病原微生物分子生物學檢測技術(shù)研究與應用.pdf

1、病原菌檢測是關(guān)系到食品衛(wèi)生、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測等多個領(lǐng)域的重要研究方向之一。檢測手段的創(chuàng)新能夠迅速推動這些領(lǐng)域的發(fā)展。本文介紹了三種基于DNA水平的病原體檢測方法的研究,其中一種和臨床診斷相關(guān),另外兩種和海洋環(huán)境病原菌污染監(jiān)測有關(guān)。這三種方法分別是:1)豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)的環(huán)介導等溫擴增檢測方法研究;2)沿岸海水中毒性創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)檢測技術(shù)的研究;3)沿岸海水中致病菌污染的檢

2、測方法研究。
　　 1)豚鼠氣單胞菌環(huán)介導等溫擴增檢測方法研究
　　 近些年來,有關(guān)于豚鼠氣單胞菌的感染病例報道越來越多,并逐漸引起人們的重視。豚鼠氣單胞菌主要在病人,尤其是兒童的糞便中分離到。目前從糞便中檢測豚鼠氣單胞菌的常規(guī)方法是選擇性培養(yǎng)和生化鑒定。這些方法需要約3～5天的時間,因此難以及時給出診斷結(jié)果。用分子生物學方法檢測豚鼠氣單胞菌無疑是更好的選擇。在本研究中,針對16S-23S rRNA基因轉(zhuǎn)錄間區(qū)(16S-

3、23S rRNA internal transcribed spacer,ITS)序列,本學位論文研究設(shè)計和驗證了一種環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal applification,LAMP)檢測豚鼠氣單胞菌的方法,并同時設(shè)計了一個特異性PCR檢測方法作為LAMP法的對照。結(jié)果表明,該LAMP檢測法特異性好、靈敏度高,和PCR方法相比,操作更簡單,檢測時間更短,并且對設(shè)備要求低,適合于推廣應用。
　　

4、 2)沿岸海水中毒性創(chuàng)傷弧菌檢測技術(shù)的研究
　　 創(chuàng)傷弧菌是一種條件致病菌,廣泛分布于河灣、沿岸海水中。它能夠引起胃腸道疾病、敗血癥和傷口感染等病癥,給沿岸居民、游客和海事工作者造成健康威脅。然而,并不是所有的創(chuàng)傷弧菌菌株都具有致病性。而目前已發(fā)表的從海水中檢測創(chuàng)傷弧菌的方法中,都沒有對創(chuàng)傷弧菌的毒性進行區(qū)分。本研究建立了兩種用于檢測毒性創(chuàng)傷弧菌的方法。一種是基于vvhA基因和viuB基因的DNA微陣列雜交法,另一種是基于創(chuàng)傷

5、弧菌毒性相關(guān)基因(vcgC)的LAMP擴增方法。此外,我們分別用了60個和30個海水樣本對這兩種方法進行了評估,結(jié)果表明這兩種方法準確、靈敏、特異性好,適合用于海水中毒性創(chuàng)傷弧菌的檢測。
　　 3)沿岸海水中致病菌污染的檢測方法研究
　　 隨著我國漁業(yè)、海水養(yǎng)殖和海濱旅游等海洋相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,海水污染越來越受到關(guān)注。而病原微生物污染是海水污染的重要方面。海水中的微生物污染的一個重要特點是來源、種類復雜多樣復雜。DNA微陣

6、列能夠同時檢測多種病原菌,解析度高,并且操作方便,快速,適合于海水病原菌污染監(jiān)測的要求。
　　 在本研究中,針對多種致病菌的16S-23S rRNA基因轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列,我們設(shè)計了特異基因探針,并整合成一個檢測這些病原菌的微陣列固定于尼龍膜上。使用一對通用引物用于PCR擴增這些病菌的ITS序列,并使地高辛摻入擴增產(chǎn)物,與DNA微陣列雜交,這一方法能夠同時檢測海水中自然存在的致病菌以及地表污染輸入的指標菌。這些菌包括霍亂弧菌(Vibi

7、o cholerae)、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolvticus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、弗尼斯弧菌(Vibriofurnissii)、擬態(tài)弧菌(Vibrio mimicus)、哈維弧菌(Vibrio harveyi)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、金黃色葡萄球菌(Stap

8、hylococcus aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、李斯特菌(Listeria spp.)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、沙門氏菌(Salmonella spp.)等。在樣本處理上,采用了過濾富集法代替培養(yǎng)增菌,增加了檢測的可靠性。因為目前使用的海水病原菌檢測方法中,都需要培養(yǎng)增菌這一步驟,然而在低溫季節(jié),許多指標菌都處于“活的非可培養(yǎng)”狀態(tài),往往會導致培