苯酚降解菌苯酚降解途徑及C23O酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、苯酚是造紙、煉焦、煉油等行業(yè)生產(chǎn)的原材料或中間體，它屬于芳香族化合物，毒性強(qiáng)且較難降解。未經(jīng)處理的含酚廢水對(duì)人類的生存環(huán)境會(huì)造成嚴(yán)重威脅。利用微生物降解的方法處理含酚廢水是一種經(jīng)濟(jì)、高效且無(wú)二次污染的方法。針對(duì)含酚廢水中酚類有機(jī)污染物的復(fù)雜性和難降解特性，引入具有較強(qiáng)的降酚能力及降解底物譜多樣性的菌種是生物強(qiáng)化處理的關(guān)鍵。因此了解強(qiáng)化菌種對(duì)酚降解的代謝途徑及關(guān)鍵酶的生化特性，是開展上述工作的基礎(chǔ)。 在前期研究工作中，篩選得到了一

2、批酚降解菌株，其中有4株菌種具有很強(qiáng)的苯酚降解能力，在苯酚廢水處理中可被用作生物強(qiáng)化菌劑縮短好氧顆粒污泥馴化時(shí)間和提高處理能力。微生物對(duì)苯酚降解途徑不同，也會(huì)有不同的特征酶。本論文依據(jù)苯酚羥化酶(Lph)、鄰苯二酚-2，3-加氧酶(C230)、鄰苯二酚-1，2-雙加氧酶(C120)三個(gè)關(guān)鍵酶的基因保守序列設(shè)計(jì)其特異PCR引物，以高效苯酚降解菌ZW(Diaphorobacter)、UW(Acineobacters)、AW(Plesiomo

3、nas)和SW(Brevibacteriums)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以分析上述關(guān)鍵酶的有無(wú)，從而分析其對(duì)苯酚降解的代謝途徑，在此基礎(chǔ)上對(duì)4種菌的芳烴底物譜、C23O酶特性以及PCR技術(shù)對(duì)環(huán)境苯酚降解微生物的檢測(cè)進(jìn)行了初步研究。 采用快速微量提取法和化學(xué)改良法提取4株菌基因組總DNA，利用Lph基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果4株菌LphPCR擴(kuò)增結(jié)果都呈陽(yáng)性。對(duì)DiaphorobacterZW菌株擴(kuò)增出的同源片

4、段進(jìn)行了DNA序列分析，該序列與已登錄的(Pseudomonassp.M1)的苯酚羥化酶基因的相關(guān)序列同源性達(dá)到97％(GenBank登記號(hào)為DQ026294.1)。進(jìn)一步利用C120基因和C230基因特異性引物對(duì)4株菌總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果4株菌的C23O基因擴(kuò)增結(jié)果都呈陽(yáng)性，而C12O基因擴(kuò)增結(jié)果都呈陰性。采用Blast程序?qū)W菌株擴(kuò)增得到的C23O同源片段進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該片段與GeneBank中已登錄的(Pseudomon

5、aspuditabacterium)的鄰苯二酚-2，3-加氧酶的相關(guān)序列相比較具有98％的同源性(GenBank登記號(hào)為X5970.1)。上述結(jié)果表明4株菌在利用苯酚時(shí)都是先通過苯酚羥化酶將苯酚轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，然后在鄰苯二酚-2，3-加氧酶作用下開環(huán)裂解進(jìn)行降解的。 C23O酶不僅是苯酚降解過程中的關(guān)鍵酶，而且還是萘、菲等多環(huán)芳烴降解的重要酶。4株菌C23O酶活的最適溫度都在35℃左右，在高于50℃后酶活都明顯下降。AW菌株耐受

6、溫度最高，40℃時(shí)依然保持較高酶活。SW、AW、UW株菌的C23O酶具有較寬的熱穩(wěn)定性范圍(10℃-40℃)，而ZW菌株則是在30℃-40℃之間有較好的熱穩(wěn)定性。在各自最適溫度下，UW菌株的C23O酶活最高，AW酶活最?。凰闹昃鶦23O酶最適pH在7-8之間。在各自最佳pH條件下，其中UW的C23O酶活最高。十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)可以顯著提高SW、AW、ZW3株菌的C23O酶活，當(dāng)CTAB濃度為0.3g/L時(shí)，SW和AW菌株的

7、C23O酶活比原來(lái)提高了兩倍多，ZW菌株提高近四倍，而CTAB對(duì)UW菌株的提高作用不大，在0.3g/LCTAB作用15分鐘后酶活有提高，但在0.1g/L-0.2g/LCTAB作用下酶活不但沒有提高，反而下降。 在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別添加萘、菲、鄰苯二酚和水楊酸作為唯一碳源，結(jié)果顯示四株菌均可以分解鄰苯二酚。SW和UW菌株可對(duì)萘和菲進(jìn)行初步降解；ZW菌株可分解水楊酸。表明這四株菌可降解的底物具有一定的廣譜性，不僅能夠降解苯酚，而且對(duì)