莠去津高效降解菌降解途徑的研究及其降解基因的克隆.pdf

1、本文首先以莠去津高效降解菌HB-5為主要研究對(duì)象，研究了HB-5降解莠去津的能力及降解途徑；另外主要從本實(shí)驗(yàn)室已有菌株中又篩選到了一株能夠礦化莠去津的降解菌HB-6，研究了HB-6降解莠去津的能力及降解途徑，并對(duì)HB-6中含有的莠去津降解基因進(jìn)行了克隆。
　　 主要內(nèi)容如下：
　　 1.介紹了莠去津的理化性質(zhì)、國(guó)內(nèi)外應(yīng)用概況，以及由于其廣泛應(yīng)用所帶來(lái)的危害；對(duì)莠去津及其降解產(chǎn)物在環(huán)境介質(zhì)中的各種檢測(cè)方法進(jìn)行了闡述；在對(duì)前

2、人工作總結(jié)分析的基礎(chǔ)上，對(duì)莠去津的降解途徑、降解基因及酶系進(jìn)行了全面系統(tǒng)的綜述，進(jìn)而提出了作者要研究的問(wèn)題。
　　 2．對(duì)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)篩選出的莠去津高效降解菌HB-5的降解途徑及降解能力進(jìn)行了研究。已經(jīng)知道HB-5能夠在24h內(nèi)將100 mg·L-1的莠去津降解完全，并且通過(guò)基因克隆發(fā)現(xiàn)，HB-5含有基因TrzN、AtzB、AtzC。將HB-5加入到以莠去津?yàn)槲ㄒ坏吹臒o(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)，分別在0h、12h、24h、4

3、8h、72h、96h、120h取樣，通過(guò)液相色譜及HPLC-MS對(duì)HB-5降解莠去津的降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，得到了HB-5對(duì)莠去津的降解能力及降解途徑。
　　 研究結(jié)果表明，在24h內(nèi)HB-5能夠?qū)⑤ソ?100 mg·L-1)降解完全，同時(shí)生成了羥基莠去津和氰尿酸。羥基莠去津在12h的時(shí)候生成量達(dá)到最大值約為20mg/L然后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸消失，于此同時(shí)氰尿酸的生成量約為96 mg·L-1，然后氰尿酸的量逐漸增加至100 mg·

4、L-1左右，不再變化。用HPLC-MS測(cè)定HB-5降解莠去津后的降解產(chǎn)物，取24h和96h樣品進(jìn)行液質(zhì)測(cè)定，在不同時(shí)間的培養(yǎng)液中檢測(cè)到了兩種降解產(chǎn)物，它們的離子大小分別為198 (M/Z)和129 (M/Z)。通過(guò)測(cè)定莠去津降解產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品和莠去津的降解途徑可以得知，這兩種物質(zhì)分別為羥基莠去津、氰尿酸。通過(guò)液相色譜和液相色譜質(zhì)譜的聯(lián)用發(fā)現(xiàn)，HB-5能夠?qū)⑤ソ蜃罱K降解至氰尿酸，而不能進(jìn)行下一步的降解。
　　 3.對(duì)實(shí)驗(yàn)室已有的菌

5、株HB-1、HB-3、HB-6、HB-7、HW-23、WB-1進(jìn)行篩選，以氰尿酸為唯一氮源，測(cè)定它們對(duì)氰尿酸的降解能力，發(fā)現(xiàn)HB-6在24h內(nèi)對(duì)氰尿酸的降解率最高，所以選擇HB-6做下一步的實(shí)驗(yàn)。另外，通過(guò)對(duì)這株細(xì)菌對(duì)莠去津的生理耐受能力及其降解能力的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)HB-6可在莠去津含量為1000 mg·L-1平板培養(yǎng)基生長(zhǎng)，而且在菌落的周圍形成一無(wú)色透明暈圈。
　　 4.將HB-6加入到以莠去津?yàn)槲ㄒ坏吹臒o(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃振

6、蕩培養(yǎng)，分別在0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h取樣，通過(guò)液相色譜及HPLC-MS對(duì)HB-6降解莠去津的降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，得到了HB-6對(duì)莠去津的降解能力及降解途徑。
　　 液相測(cè)定的結(jié)果為，在24h內(nèi)HB-6能夠?qū)⑤ソ?100mg·L-1)降解完全，同時(shí)生成了羥基莠去津和氰尿酸。羥基莠去津在12h的時(shí)候生成量達(dá)到最大值約為10 mg·L-1然后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸消失，于此同時(shí)氰尿酸也達(dá)到它的最大值約60

7、mg·L-1，然后隨著時(shí)間的推移羥基莠去津及氰尿酸逐漸被完全降解。用HPLC-MS測(cè)定HB-6降解莠去津后的降解產(chǎn)物，在不同時(shí)間的培養(yǎng)液中我們檢測(cè)到了三種降解產(chǎn)物，它們的離子大小分別為198 (M/Z)，129 (M/Z)和 60 (M/Z)。我們通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)樣品和莠去津的降解途徑可以得知，這三種物質(zhì)分別為羥基莠去津、氰尿酸和尿素。而且在144h培養(yǎng)液中無(wú)其它降解產(chǎn)物，只有尿素，這就充分說(shuō)明HB-6能夠礦化莠去津。
　　 5.高效降

8、解菌對(duì)莠去津的降解特性試驗(yàn)表明：培養(yǎng)溫度和pH條件對(duì)降解菌的生長(zhǎng)及其對(duì)莠去津的降解有很大的影響，適宜降解菌生長(zhǎng)及其對(duì)莠去津降解的溫度在20℃～40℃之間，pH在6.0～9.0之間；高濃度的莠去津?qū)到饩纳L(zhǎng)及降解能力有抑制作用。
　　 6.通過(guò)菌種的形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)及16SrDNA對(duì)降解菌HB-6進(jìn)行了鑒定，并且與NCBI已有菌種進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果表明HB-6為枯草芽孢桿菌。
　　 7.對(duì)莠去津高效降解菌HB-6中的莠