生理生化試驗

1、熒光定量PCR技術(shù)及其在科研中的應(yīng)用孫沖南京林業(yè)大學(xué)森環(huán)學(xué)院江蘇南京210037[摘要]熒光定量PCR技術(shù)是一種新型的核酸定量技術(shù)，與常規(guī)的PCR相比，熒光定量PCR具有檢測靈敏，精確，特異性強，無污染，快速等特點。自問世以來在基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛。在植物研究方面應(yīng)用較少。現(xiàn)已開始用于植物基因表達(dá)分析、外源基因基因鑒定等方面的研究。本文介紹了實時熒光定量PCR技術(shù)的原理、試驗方法、優(yōu)缺點，并對其在

2、植物研究中的應(yīng)用及前景作了探討。[關(guān)鍵詞]實時熒光定量PCR技術(shù)；原理；植物；檢測；應(yīng)用；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）技術(shù)是1985年開始出現(xiàn)的一項基因檢測技術(shù)。由于PCR技術(shù)簡便易行、靈敏度高等優(yōu)點，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究，成為分子生物學(xué)必不可少的研究工具。由于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)存在，不能準(zhǔn)確定量，且操作過程中易污染而使得假陽性率高等缺點，使其應(yīng)用受到局限。實時熒光定量PCR技術(shù)是在PCR基

3、礎(chǔ)上發(fā)展起來的，將核酸擴(kuò)增、雜交、光譜分析和實時檢測等技術(shù)融合在一起的一項創(chuàng)造性技術(shù)。自產(chǎn)生以來，在醫(yī)學(xué)、檢疫、國防軍事及農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。該技術(shù)帶來了方法學(xué)上的重要突破，在植物學(xué)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。1.實時熒光定量PCR技術(shù)的概念及基本原理實時熒光定量PCR技術(shù)（RealtimefluescentquantitativePCR，RealtimeQPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，利用熒光信號來實時

4、監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板濃度進(jìn)行定量分析。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長。儀器可以自動檢出，利用熒光信號積累，實時監(jiān)測別是DNA結(jié)合染料法、水解探針法、雜交探針法、熒光引物法。但在植物中常用的檢測模式主要有兩種：熒光染料檢測和熒光水解探針檢測。3.1雙鏈DNA結(jié)合染料SYBRGreenI技術(shù)SYBRGreenI是一種替代溴化乙錠能結(jié)合到dsDNA小溝部位的具有綠色激發(fā)波長的染料

5、，它只有與dsDNA結(jié)合后才會發(fā)出熒光。當(dāng)DNA解鏈成為單鏈時，它從鏈上釋放出來，這時熒光信號急劇減落。因此，熒光強度可以代表擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量。其最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。SYBRGreenI結(jié)合到雙鏈DNA后，熒光強度大大增加，具有較強的敏感性，且不必因為模板不同而特別定制，因此設(shè)計的程序通用性好，操作簡便，且價格相對較低，故廣泛應(yīng)用于實時定量PCR研究中。但由于SYBRGreenI非特異結(jié)合雙鏈DNA，引

6、物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性。通過升高溫度后測量熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。由溶解曲線分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBRGreenI得到的定量結(jié)果。此外，設(shè)計引物時避免引物二聚體的出現(xiàn)，在PCR過程中建立不加模板的陰性對照，在試驗結(jié)束后，進(jìn)行凝膠電泳分析等方法的實施可以有效保證試驗結(jié)果的可靠性。3.2熒光探針檢測技術(shù)根據(jù)標(biāo)記基團(tuán)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluescenceresonan