目的基因的制備

1、2024/3/21,1,第五章 目的基因的制備,第一節(jié) 目的基因的制備第二節(jié) 目的基因的分離,2024/3/21,2,一 概 述,基因工程或DNA重組技術(shù)三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因。,目的基因,確定其表達調(diào)控機制和生物學(xué)功能,建立高效表達系統(tǒng),構(gòu)建具有經(jīng)濟價值的基因工程菌（細(xì)胞）,體外進行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾,輸回細(xì)胞內(nèi)改良生物體遺傳性狀，包括人體基因治療,,,,,,,,,2024/3/21,3,二

2、什么是目的基因,基因工程的主要目的是使優(yōu)良性狀相關(guān)的基因聚集在同一生物體中，創(chuàng)造出具有高度應(yīng)用價值的新物種。為此必須從現(xiàn)有生物群體中，根據(jù)需要分離出此類基因，即準(zhǔn)備要分離、改造、擴增或表達的基因通常稱之為目的基因。如抗逆性相關(guān)基因（抗病、抗寒等）、生物藥和保健品相關(guān)基因、毒物降解相關(guān)基因 、工業(yè)用酶等相關(guān)基因等。,2024/3/21,4,,一般來說，目的基因的制備戰(zhàn)略分為兩大類一類是構(gòu)建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基

3、因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克??；另一類是利用PCR擴增技術(shù)甚至化學(xué)合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達。,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,5,第一節(jié) 目的基因的制備,1、直接法制備基因2、從基因組文庫中釣取目的基因3、從cDNA文庫中釣取目的基因4、通過PCR直接擴增出目的基因,2024/3/21,6,1.1 限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法,限制性內(nèi)切酶酶切分離法

4、適于從簡單基因組（如質(zhì)粒和病毒）中分離目的基因。①對已定序的DNA分子，只需用已知識別序列的限制性核酸內(nèi)切酶進行一次或幾次切割，分離純化所需DNA片段，與適當(dāng)載體重組后轉(zhuǎn)化受體菌后即可得到目的基因的克隆。②對已知定位的目的基因，只要根據(jù)目的基因兩側(cè)的已知的限制性內(nèi)切酶識別位點，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割，一次就可獲得目的基因。,2024/3/21,7,所謂基因就是具有特定生物學(xué)功能的一段核苷酸序列，所以只要掌握了其分子結(jié)構(gòu)，完全可以在

5、實驗室進行人工合成。 1977年，利用化學(xué)途徑首次合成了編碼腦激素的基因（生長激素釋放因子基因），并在大腸桿菌中實現(xiàn)了成功的表達。從此，化學(xué)合成基因得到了很大的發(fā)展迅速。,早期通過化學(xué)合成的部分基因,基因人胰島素轉(zhuǎn)運RNA?-干擾素腸促胰液肽尿抑胃激素?-干擾素,大?。╞p）12654281162453,合成年代197819791981198219821984,基因視紫紅質(zhì)前腦菲肽

6、ATP酶溶菌酶RNA酶T1RNA酶Ａ,大?。╞p）105777170385324375,合成年代198519851985198519861987,,,,1.2 化學(xué)法直接合成基因,2024/3/21,8,,1.2.1.1小片段粘接法：,混合退火,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

7、,T4-DNA連接酶連接,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,克隆入合適的載體,,,1.2.1 化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略,全基因合成有三種戰(zhàn)略：,2024/3/21,9,,混合退火,,,,,,,,,,,T4-DNA連接酶連接,,,,,,,,,,,,,,克隆入合適的載體,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Klenow酶聚合,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,1.2.1.2 補釘延長法,根據(jù)目的基因兩條互補鏈全序列，分別

8、合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長的單鏈DNA中片段,,2024/3/21,10,根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈DNA片段,混合退火,,,T4-DNA連接酶連接,,克隆入合適的載體,,,,Klenow酶聚合,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,1.2.1.3 大片段酶促法,,2024/3/21,11,1.2.1.4 三種方法各有利弊,化學(xué)合成DNA的單片段愈短，收率

9、就愈高，但由于化學(xué)合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學(xué)合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學(xué)合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為95%則合成50個堿基長的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%,2024/3/21,12,,,1.2.2 化學(xué)合成的單元操作,化學(xué)合成DNA的實質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上去，每接一個單體就是一個循環(huán)反應(yīng)，包括：基團保護、分離、縮合、分離、去保護五大操作

10、單元。 從反應(yīng)機理上來講，DNA化學(xué)合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡便，DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸三酯法原理設(shè)計的,2024/3/21,13,,,,,,O,,H,G,,H,,,H,H,H,O,CH,2,,O,,DMT,,P,,O,Me,,,N,,CH,,Me,,Me,,CH,,,Me,Me,,H,,,,,,,,,,,

11、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,激活,縮合,氧化,脫取代基,玻璃珠,化學(xué)合成的單元操作,DMT： 二甲氧基三苯甲基,連接臂,2024/3/21,14,,,合成天然基因,修飾改造基因,設(shè)計新型基因,制備探針、引物、接頭,,,1.2.3 DNA化學(xué)合成的用途,如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素基因等,如組織型纖溶

12、酶原激活劑基因、尿激酶原基因等,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,15,第一節(jié) 目的基因的制備,1 直接法制備基因2 從基因組文庫中釣取目的基因3 從cDNA文庫中釣取目的基因4 利用PCR直接擴增出目的基因,2024/3/21,16,,對于高等真核生物而言，基因組DNA龐大，組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，存在間隔序列和重復(fù)序列，因此，單個目的基因在整個基因組中所占的比例極其微小，大多數(shù)基因難以直接分離得到。為了解決這個難題，可行

13、的方法就是將這個基因擴增，增加成功分離目的基因的可能性。但是由于要分離的目的基因往往是未知基因，因此無法對它進行特異性擴增,而只能對所有的基因進行擴增，也就是構(gòu)建該生物材料的基因組文庫。然后再根據(jù)不同的方法將所需的克隆篩選出來。,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,17,2、從基因組文庫中釣取目的基因,2.1基因文庫的構(gòu)建2.1.1基因文庫的基本概念基因庫(gene pool):特定生物體全基因組的集合（天然存在） 基

14、因文庫(gene library or gene bank):從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構(gòu)建）一個受體菌的群體之中 , 這個群體即為這種生物的基因文庫。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為:基因組文庫（含有全部基因）； cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,18,2.1.2 基因文庫構(gòu)建的材料來源,,,,,,材料來自染色體DNA或mRNA

15、 在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時段的mRNA一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等。很顯然， cDNA文庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫種類不同（即基因的表達譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫,2024/3/21,19,2.1.3 基因文庫的完備性,基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：其中：P=任一基因被克?。ɑ虼嬖?/p>

16、于基因文庫中）的概率，f=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小,N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ),例如，人的單倍體DNA總長為2.9 x 109 bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為15 kb，則構(gòu)建一個完備性為0.9的基因文庫至少需要45萬個克??；而當(dāng)完備性提高到0.9999時，基因文庫至少需要180萬個克隆,2024/3/21,20,For example : 期望值為0.99，插入片斷為

17、20kb的 E.coli (4.6×106 bp) 和 human (3×109 bp) 基因組的克隆數(shù)的計算 N E.coli= =1.1 ×103,,ln( 1-0.99),ln[1-(2×104/4.6×106)],Nhuman=

18、 = 6.9 ×105,,ln(1-0.99),ln[1-(2 ×104/3 ×109)],這個例子說明用質(zhì)粒載體（插入片段5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文庫，只需要幾千個克??；而真核生物則需要更大承載能力的載體。,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,21,2.1.4基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的

19、總數(shù)不宜過大 以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度 避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域 以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選,,,,,2024/3/21,22,2.1.5基因文庫的構(gòu)建技術(shù)路線,①材料的選擇及基因組DNA的制備；②載體的選擇；③載體與基因組DNA的限制性酶切；④ 載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞；⑤ 重組克隆的篩選和

20、保存。,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,23,2.1.5.1 基因組DNA的制備,,,,,,文庫構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。制備的DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高,用常規(guī)方法制備的染色體DNA的長度一般在100 kb左右。如果先將細(xì)胞固定在低融點凝膠中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1000 kb大小的

21、DNA片段,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,24,2.1.5.2 載體的選擇,出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC或BAC載體。由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒。上述幾種載體的最大裝載量如下：,l-DNA,質(zhì)粒,考斯質(zhì)粒,10 kb,23 kb,45 kb,BAC,300 k

22、b,用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,25,2.1.5.3 載體與基因組DNA的切割,,,用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：第一 保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)。第二 保證DNA片段大小均一。超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭。部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，這樣DN

23、A酶解片段的大小可控。連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體。,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,26,2.1.5.4 載體與外源片段的連接（1） 連接酶,DNA連接酶；T4 DNA連接酶；E.coli DNA連接酶它們都可以催化5’末端磷酸和3’末端羥基形成磷酸二酯鍵。但由于T4 DNA連接酶既能連接粘性末端還能連接平末端，而E.coli DNA連接酶

24、主要連接粘性末端，所以一般連接反應(yīng)中都用T4 DNA連接酶。,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,27,（2）連接反應(yīng)的效率,連接反應(yīng)的效率和連接產(chǎn)物的組成與DNA末端的特性、DNA末端的濃度以及所用的連接酶量有關(guān)。平末端連接反應(yīng)的效率相對較低，它需要較高濃度的平末端、較大的連接酶量、較低濃度的ATP以及不能有象亞精胺一類的多胺。在連接反應(yīng)中加入15％的PEG 8000或1～1.5pmol／L 氯化六氨合鈷等濃縮劑可極大地

25、促進平末端反應(yīng)的連接速度，同時可改變不同連接產(chǎn)物的比例，使連接產(chǎn)物增多。,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,28,（3）避免外源DNA片段之間的連接措施,在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最應(yīng)引起重視的問題是：嚴(yán)禁外源DNA片段之間的連接！?。榱吮苊馍鲜銮闆r的發(fā)生，可采取下列措施的組合： 將待連接的DNA片段根據(jù)載體的裝載量分級分離用堿性磷酸單酯酶除去DNA片段的末端磷酸基團 用酶在DNA片段的末端上增補同聚尾末端,202

26、4/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,29,,,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,30,2.1.5.5 重組DNA導(dǎo)入宿主及篩選,轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)染感染結(jié)合其它,2024/3/21,31,密集鋪板（1-10萬）,,,,,,,,雜交,挖取,目的重組克隆,鋪板,鋪板,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,32,構(gòu)建噬菌體基因組文庫的主要步驟,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,33,用粘粒載體建立基因組

27、文庫的主要步驟,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,34,2.1.5.6 基因組文庫重組克隆的排序,大型基因文庫（包括人的基因文庫）的構(gòu)建在技術(shù)上并不十分困難，如果一個YAC基因文庫的插入片段總和為整個基因組的十倍以上時，一般就能從基因文庫中調(diào)出任何一段DNA序列。然而基因文庫的克隆都是隨機序列，必須將所有的克隆排列成一個像天然染色體DNA上所表現(xiàn)出的信息順序。這項工作的工作量可能遠(yuǎn)大于基因組文庫的構(gòu)建，屬于基因文庫的后期

28、制作,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,35,（1）酶切片段末端標(biāo)記法,將單一的YAC克隆插入DNA片段用限制性內(nèi)切酶分布均勻地水解成若干片段，末端標(biāo)記同位素。然后再用Sau3A I或Mbo I將末端標(biāo)記的DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝膠電泳，每10個YAC克隆走在同一塊板上，形成10個克隆的特征性DNA指紋圖譜電腦分析指紋圖譜，如發(fā)現(xiàn)任何兩個克隆DNA的指紋圖譜有部分相同的，則其兩個YAC片段就有互相重疊的可能性，

29、于是這兩個YAC克隆的DNA片段克隆在染色體上是排列一起的,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,36,,,,,,,H,H,H,,,,H,,,,,,,,,,,,,,S,S,S,S,,,,,S,S,S,,,,,S,S,S,,,,,,,,S,S,S,S,S,S,S,S,S,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

30、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,單一克隆指紋圖譜,十克隆指紋圖譜,載體DNA,克隆DNA,,,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,37,（2）隨機探針聯(lián)合雜交法,將若干YAC克隆固定在薄膜上，并復(fù)制二十份薄膜；合成20種不同序列的短探針，其序列是隨機的。用20種探針隨機定位雜交（一對一）20份YAC克隆薄膜。如果某兩個克

31、隆同時對同一種探針呈現(xiàn)雜交陽性反應(yīng)，則這兩個克隆有可能是相互重疊的。若將雜交陽性結(jié)果記為“1”，而陰性結(jié)果記為“0”，可清晰地列成一張表，最終排出上述YAC克隆的排列順序 。,2024/3/21,38,,,01,02,03,04,05,06,07,08,09,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,A B C DE FG,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,01,02,03,04,

32、05,06,07,08,09,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,D,A,B,C,E,F,G,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,2024/3/21,39,,01,04,12,06,13,14,02,17,07,19,11,15,05,08,16,03,10,09,20,18,D,A,B,C,E,F,G,1,1,1,1,1,

33、1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,,,F,,C,,A,,D,,G,,E,,B,2024/3/21,40,（3）染色體走讀法（chromosome walking）,從基因文庫中任取一個克隆作為染色體走讀的起點，將之兩端序列分別亞克隆，亞克隆片段在0.5~ 2.0 kb范圍內(nèi)分別以上述亞克隆DNA片段為探針，雜交同一基因文庫，雜交陽性克隆中的插入DNA片段必定與起點克隆所

34、含的DNA片段連鎖在一起然后再以陽性克隆片段的兩端序列為探針，進行第二步走讀，直至線型染色體DNA的端點,2024/3/21,41,染色體走讀法（chromosome walking）,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

35、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,走讀的起點克隆片段,亞克隆旁測序列,探針標(biāo)記,第一輪雜交,,,陽性克隆,陽性克隆,第二輪雜交,第二輪雜交,2024/3/21,42,染色體走讀法（chromosome walking）,,走讀的起點克隆片段,,,,,,,,2024/3/21,43,2.1.5.7 從基因組文庫中釣取目的基因,構(gòu)建了基因文庫僅僅是完成了基因克隆，并不等于完成了基因分離。構(gòu)建成的文庫僅是一個雜亂無章的“基因

36、圖書館”，要想從中找到所需基因，必須有一些相關(guān)線索。分離目的基因也要知道與目的基因有關(guān)的某些或某個特征，才能據(jù)此找到相關(guān)基因。主要方法有：核酸雜交方法；免疫學(xué)檢測方法；DNA同胞選擇法（極少用）；PCR篩選法；其他方法。,2024/3/21,44,（1）核酸雜交方法,適用于大量篩選，常用，可靠。但需制備探針，所用探針有多種，獲得探針的方法很多；,（2）免疫學(xué)檢測方法,（3）DNA同胞選擇法（極少用）,使用抗體探針，通過檢測重組

37、克隆表達出的蛋白質(zhì)來篩選目的克隆。只適用于表達文庫的篩選，并只能篩選出表達了的克隆。,DNA同胞選擇法是按矩陣分值亞庫，用mRNA與cDNA雜交后釋放出mRNA ，使其在無細(xì)胞蛋白合成體系中翻譯，并對翻譯產(chǎn)物進行免疫沉淀、PAGE電影鑒定或活性分析等來篩選目的快樂，該方法要求全長cDNA，一般只在無其他方法可用或表達產(chǎn)物很小時才用,2024/3/21,45,（4）PCR篩選法,其顯著特點是快速、簡便。該方法的基本策略是采用“反應(yīng)池” ，

38、將基因文庫分裝96孔培養(yǎng)板，如有2304個克隆分別置于24個96孔培養(yǎng)板中，現(xiàn)以反應(yīng)板為單位，將96個克隆混合成一個“反應(yīng)池”，進行一個PCR反應(yīng)，如圖：,2024/3/21,46,從24個反應(yīng)板中找出具有陽性克隆的反應(yīng)板，再將該板中的12個橫向克隆與8個縱向克隆分別混合，形成12個橫向池及8個縱向池，進行20個（8+12）反應(yīng)，如圖，橫向陽性池與縱向陽性池交叉的孔為陽性單克隆，通過44個反應(yīng)可從2304個克隆中篩選分離出單個克隆。,2

39、024/3/21,47,大腸桿菌作為寄主進行DNA克隆的實驗方案,DNA片段的獲得,載體構(gòu)建,細(xì)菌轉(zhuǎn)化,重組體的鑒定,限制性內(nèi)切酶消化,機械切割,雙鏈cDNA的合成,化學(xué)法直接合成,同聚物加尾,粘性末端連接,平末端連接,加接頭造成粘性末端,重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)染,重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化,體外包裝進行轉(zhuǎn)導(dǎo),表型鑒定,核酸雜交,免疫學(xué)分析,酶切鑒定,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的

40、制備,48,2.1.5.7從基因組文庫中釣取目的基因總結(jié)圖,圖克隆策略的一般總結(jié)，箭頭顯示了最佳路線。注意，在以細(xì)胞為基礎(chǔ)的克隆策略中，DNA最初是由非特異性的方法并克隆的，因此在結(jié)尾步驟需要篩選出目標(biāo)克隆。相反地，當(dāng)特異性的DNA片段是通過PCR或直接化學(xué)合成的方式獲得的時候，也就不需要后續(xù)的篩選了。,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,49,第一節(jié) 目的基因的制備,1、直接法制備基因2、從基因組文庫中釣取目的基因3、

41、從cDNA文庫中釣取目的基因4、通過PCR直接擴增出目的基因,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,50,3 從cDNA文庫中釣取目的基因,3.1 cDNA文庫的構(gòu)建3.2 cDNA克隆的操作流程,2024/3/21,51,3.1.1. cDNA,以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。,3.1.2. cDNA library,mRNA,cDNA,,3’,3’,5’,5’,反轉(zhuǎn)錄酶,引物,利用某種生物的總mRNA合成

42、cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進行保存和擴增，稱cDNA文庫。,3.1 cDNA文庫的構(gòu)建,2024/3/21,52,（1）不含內(nèi)含子序列。 （2）可以在細(xì)菌中直接表達。 （3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。 （4）比DNA文庫小的多，容易構(gòu)建。,3.1.4. 構(gòu)建cDNA文庫的一般步驟,（1）總RNA（total RNA）提取,3.1.3. cDNA文庫的特點,提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。,20

43、24/3/21,53,分離mRNA用商業(yè)化的Oligo dT纖維柱。,利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。 mRNA只占總RNA的1%-2%。,（2）mRNA的分離純化,① 原理,② mRNA的分離純化,Column（柱）,2024/3/21,54,,,2024/3/21,55,反轉(zhuǎn)錄酶,（3）cDNA的合成,① cDNA第一鏈合成,逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。 用O

44、ligo dT（或隨機引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。,mRNA,cDNA,,3’,5’,5’,AAAAAAA,TTTTTTT,Oligo dT引物,,2024/3/21,56,用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。,mRNA,cDNA,3’,3’,5’,5’,反轉(zhuǎn)錄酶,引物,mRNA,cDNA第一鏈,3’,3’,5’,5’,引物,,,cDNA第一鏈,3’,5’,引物,,② 降解mRNA模板,或RNase

45、H,堿,2024/3/21,57,,,,剩下的cDNA單鏈的3’末端一般形成一個彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA.。,cDNA第一鏈,5’,cDNA第二鏈合成,DNA聚合酶,,cDNA第一鏈,cDNA第二鏈,5’,3’,,③ cDNA第二鏈合成,,,,,2024/3/21,58,,④去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu),核酸酶S1,,,用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會導(dǎo)致cDNA中有用的序列

46、被切掉?。?。,cDNA第一鏈,cDNA第二鏈,5’,3’,cDNA第一鏈,cDNA第二鏈,5’,3’,5’,3’,,2024/3/21,59,在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌?；蚪柚┒宿D(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。,3.1.5.cDNA與載體連接：,,,,,,,,,,接上人工接頭,粘性末端,,,,,CCC,CCC,,末端轉(zhuǎn)移酶,,,,,2024/3/21,60,,202

47、4/3/21,61,3.2 cDNA克隆的操作流程,隨著cDNA從克隆經(jīng)驗的積累和方法的不斷改進，逐漸形成了下列相對成熟和標(biāo)準(zhǔn)的構(gòu)建cDNA文庫的操作流程。①轉(zhuǎn)錄酶以oligo(dT)為引物合成cDNA第一鏈。②用RNase H和大腸桿菌聚合酶Ⅰ等合成cDNA第二鏈。③cDNA的甲基化(非必需步驟)。④cDNA與接頭連接，并經(jīng)限制酶消化產(chǎn)生黏性末端。⑤cDNA的分部收集(非必需步驟)。⑥cDNA與末端匹配的載體連接。⑦重

48、組cDNA導(dǎo)人宿主菌。,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,62,第一節(jié) 目的基因的制備,1、直接法制備基因2、從基因組文庫中釣取目的基因3、從cDNA文庫中釣取目的基因4、通過PCR直接擴增出目的基因,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,63,4 通過PCR直接擴增出目的基因,前提:目的基因的全序列或其兩側(cè)序列為已知，合成一對與模板DNA互補的引物，擴增出DNA片段。模板：基因組DNA，mRNA序列，或是

49、已克隆到某一載體上的基因片段。為了克隆操作的方便或保證克隆后續(xù)工作需要，常常要在設(shè)計引物時對其兩端作一些修飾，如 帶限制性內(nèi)切酶切點,某種啟動子序列或起始或終止密碼等,便于下一步的重組克隆和基因的表達和調(diào)控研究。,2024/3/21,64,通過PCR直接擴增出目的基因策略,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,65,,優(yōu)缺點：與傳統(tǒng)的DNA克隆方法比較，省時、省力, 但要求待擴增的DNA片段的序列必需是已知的，至少要求兩端長約2

50、0bp的序列是已知的。另外，合成的DNA片段長度有限，一般在2kb以內(nèi)，超過2kb時擴增效果顯著下降。如要大量擴增未知序列的特異DNA片段，或是更長的DNA片段，則須選擇特殊類型的PCR策略。通常PCR反應(yīng)有如下幾種類型:,2024/3/21,66,4.1 套式 PCR（nested PCR）,也叫巢式PCR，是指用兩對引物擴增同一樣品的方法。即在兩對引物中，一對引物與靶序列的復(fù)性結(jié)合位點處于另一對引物擴增的DNA序列內(nèi)，前者稱為內(nèi)

51、部引物，后者稱為外側(cè)引物。一般先用外側(cè)引物擴增一段較長的靶序列，然后以第一次擴增的產(chǎn)物為模板，再用內(nèi)部引物擴增其中的部分片段。套式 PCR較常規(guī)PCR靈敏度大大提高，同時也有較強的的特異性，假陽性極少。,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,67,4.2 反向 PCR(inverse PCR),當(dāng)一個未知序列位于已知序列的上游，一般可用已知靶序列的一個引物( 即與3‘端互補的引物)進行單向PCR線性擴增, 而反向PCR技術(shù)則可

52、利用二個靶序列引物對未知片段進行常規(guī)PCR擴增。反向PCR包括下列三個步驟,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,68,首先，用限制性核酸內(nèi)切酶消化待測線性DNA模板。其次，使酶切后的線性 DNA 模板連接成為環(huán)狀分子，或加上銜接頭后再連接成環(huán)狀。第三，用另一種限制酶消化，將環(huán)狀DNA從已知區(qū)域中間切開，則線性化DNA的兩側(cè)為已知序列，未知區(qū)域夾在中間，用與已知區(qū)域可使未知序列大量擴增出來。,2024/3/21,第一節(jié) 目

53、的基因的制備,69,4.3 錨定 PCR(anchored PCR),錨定PCR，又稱為單側(cè)PCR，是指通過添加錨定引物接頭的方式來擴增合成未知序列或未全知序列的方法。常見的錨定PCR類型是利用未知序列中一小段已知序列的信息來擴增合成已知序列上游或下游片段，最后獲得全部序列。,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,70,其基本步驟,與此po1y(dG)相對應(yīng)的poly(dC)即為錨定引物。為保證擴增特異性，錨定引物通常在12

54、堿基以上。在錨定引物和與基因特異配對的引物參與下，可以擴增帶有同源多聚物尾巴的cDNA序列。與基因特異配對的引物通常是在未知序列中一小段已知序列的基礎(chǔ)上設(shè)計合成的，而該已知序列一般是由純化蛋白的部分氨基酸序列推測出來或從其他材料中獲得的部分mRNA序列。,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,71,4.4 反轉(zhuǎn)錄 PCR（RT-PCR）,RT-PCR，是將mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR技術(shù)相偶聯(lián)的一種基因分離技術(shù)。通過mRNA反轉(zhuǎn)錄，得

55、到對應(yīng)的cDNA，然后利用特定的PCR引物直接以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增反應(yīng)，獲得大量所需的基因。反轉(zhuǎn)錄可用總RNA或總poly(A)RNA為模板進行，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也無須轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA,即可進行PCR擴增。,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,72,第一 連續(xù)RT-PCR( 兩階段單管式 ),由mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA和DNA的PCR擴增是兩個完全不同的酶催化反應(yīng)過程，連續(xù)RT-PCR將這兩種不同的酶催化

56、過程放在一個管中連續(xù)反應(yīng)，但在空間上兩種反應(yīng)仍是分開進行。在該程序中利用一種特制蠟燭冷卻形成的蠟層，將兩種反應(yīng)混合物分開成上下兩層，反應(yīng)首先在較低的溫度下進 行反轉(zhuǎn)錄，由mRNA合成cDNA；當(dāng)反應(yīng)結(jié)束, 溫度升高到95℃，使蠟層熔化，上下層反應(yīng)液混合在一起，下層混合物中的TaqDNA聚合酶利用上層合成的cDNA作為模板進行PCR擴增。,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,73,第二 長距離 RT-PCR( 兩階段雙管式 )

57、,長距離RT-PCR與連續(xù)RT-PCR都是使兩種酶促反應(yīng)分開進行，但長距離RT-PCR能擴增全長cDNA，得到更長的DNA 產(chǎn)物。在反轉(zhuǎn)錄階段，首先使模板——引物融合，然后再加入反應(yīng)混合物并預(yù)熱，最后加逆轉(zhuǎn)錄酶，這樣便分別滿足各個步驟的最適條件。進行PCR循環(huán)時，首先進行95℃熱起始，再加入Taq DNA聚合酶，采用雙 shuttle PCR 程序延長合成時間，由此擴增出長達 4～6 kb的DNA片段。,2024/3/21,第一節(jié)

58、目的基因的制備,74,4.5 鍋柄 PCR（panhandle PCR）,用PCR擴增未知序列，因為不能設(shè)計所需要的引物而難以實現(xiàn)。鍋柄PCR就是為擴增未知序列而設(shè)計的一種策略。如果一段未知序列處于已知序列的上游，那么可根據(jù)已知的3‘端序列設(shè)計引物而擴增出未知序列，如果未知序列位于已知序列下游則須將5’端的已知序列拷貝到未知序列的下游，這樣使未知序列的兩側(cè)都含有已知序列，據(jù)此可以擴增未知片段，也能從3‘，5’兩端測定已知基因的序列。

59、,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,75,鍋柄 PCR實施步驟,①用內(nèi)切酶消化環(huán)狀dsDNA產(chǎn)生5‘黏末端線型DNA片段，用Klenow酶填平5’黏末端，然后用BAP脫去5'磷酸，避免自我環(huán)化。②合成一個與5‘末端堿基和已知基因的5’端內(nèi)部某個區(qū)域能互補的附加引物，與上述線性化片段的3’端連接，5'端由于脫磷而不能連接。,2024/3/21,第一節(jié) 目的基因的制備,76,,③將連接物變性后再冷卻復(fù)性，其中

60、一條單鏈DNA分子(負(fù)鏈)由于附 加引物而與互補區(qū)域以堿基配對形成鍋柄狀的鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)，而正鏈的附加引物是不能互補的。④鍋柄結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)一個龜縮的3‘端，它可作為引物進行 PCR 擴增，經(jīng)變性成單鏈后而使未知區(qū)域的3’，5'兩側(cè)都帶有完整的已知基因序列。,2024/3/21,77,,⑤以3‘ 端的引物進行單向PCR擴增，合成另一條鏈，不過如果全部序列太長，則難以達到5’端的已知區(qū)域，得不到全長片段。⑥變性后再次冷卻生成鏈內(nèi)二級

61、結(jié)構(gòu)，得到另一條鏈的模板，龜縮的3‘端同樣可作引物進行PCR擴增而得到全長片段，其中未知基因處于中間，3‘、5' 兩側(cè)是已知基因的全序列。⑦套式PCR: 用引物對(l)和(2)或(3)分別作外側(cè)引物和內(nèi)部引物可以擴增不同長度的DNA片段，其中包括完整的已知序列。,2024/3/21,78,第五章 目的基因的制備,第一節(jié) 目的基因的制備第二節(jié) 目的基因的分離,2024/3/21,79,第二節(jié) 目的基因的分離,1 目的基

62、因的功能克隆2 序列克隆法3 差別雜交及減法雜交技術(shù)4 差示分析法5 功能結(jié)合法6 其他方法,2024/3/21,第二節(jié) 目的基因的分離,80,第二節(jié) 目的基因的分離,在基因文庫中,不論是cDNA文庫還是基因組DNA文庫,含 目的基因的克隆子都只是數(shù)以萬計的克隆子中的一個,究竟哪一個克隆子含有我們所要研究的目的基因？因此克隆一個基因的下一個步驟就是從基因文庫中篩選分離出含有目的基因的特定克隆子。這個步驟可以依據(jù)待

63、分離目的基因的有關(guān)特性,如基因的序列、功能、在染色體上的位置和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA等,建立相應(yīng)的方法加以完成。,2024/3/21,81,第二節(jié) 目的基因的分離,1 目的基因的功能克隆篩選2 序列克隆法篩選3 差別雜交及減法雜交技術(shù)篩選4 差示分析法篩選5 功能結(jié)合法篩選6 其他篩選方法,2024/3/21,第二節(jié) 目的基因的分離,82,1 目的基因的功能克隆篩選法,1.1 根據(jù)特異蛋白分離目的基因在基因工程發(fā)

64、展的早期階段，有關(guān)功能基因的分離與克隆多是在特異蛋白分離、純化和測序的基礎(chǔ)上完成的。這也是通常所說的目的基因的功能克隆策略。,基本過程是：,2024/3/21,第二節(jié) 目的基因的分離,83,1.2 功能互補法克隆基因,功能互補克隆技術(shù)，是利用被克隆的DNA片段與寄主細(xì)胞的染色體DNA在功能上有同源互補性來進行目的基因直接分離的。一種最簡單的方式是，將大腸桿菌DNA的克隆片段“庫”中的重組DNA分子分別導(dǎo)入一種大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型菌株的

65、受體細(xì)胞，然后將此受體細(xì)胞涂布在一種缺少該菌株所需要的營養(yǎng)底物的基本培養(yǎng)基上結(jié)果只有那些獲得了營養(yǎng)缺陷型互補基因的受體細(xì)胞才會長成轉(zhuǎn)化子菌落。,2024/3/21,84,第二節(jié) 目的基因的分離,1 目的基因的功能克隆篩選2 序列克隆法篩選3 差別雜交及減法雜交技術(shù)篩選4 差示分析法篩選5 功能結(jié)合法篩選6 其他篩選方法,2024/3/21,第二節(jié) 目的基因的分離,85,2 序列克隆法篩選,2.1 根據(jù)已知基因

66、序列或同源基因序列分離目的基因 最直接方法是用核酸探針進行雜交篩選?？上葟腄NA序列數(shù)據(jù)庫中查找有關(guān)基因的序列，再用該基因序列或其一部分作為探針篩選該基因的克?。辉谧匀唤绲拈L期進化過程中，一些蛋白質(zhì)的基因編碼序列保持著高度的保守性，因此在生物的種、屬之間，基因編碼序列有著很高的同源性。如果某種生物的同源基因已被克隆，則可以利用該基因或其部分序列制備探針來篩選基因文庫，再對陽性克隆進行測序，并與已知基因序列或同源性序列進行比較，最后

67、經(jīng)轉(zhuǎn)化鑒定是否為待分離的基因。,2024/3/21,第二節(jié) 目的基因的分離,86,把濾膜放在平板上，將噬菌斑中的噬菌體顆粒影印到濾膜上，使噬菌體DNA結(jié)合在濾膜上。把濾膜放入含有放射性標(biāo)記的探針的溶液中雜交。雜交后洗去膜上非結(jié)合的探針，經(jīng)放射自顯影確定。然后根據(jù) X 線片上的放射性位點尋找相應(yīng)的噬菌斑，從而分離到與探針順序互補的目的克隆。,基本過程圖,2024/3/21,第二節(jié) 目的基因的分離,87,2.2 表達序列標(biāo)簽法分離目的基

68、因,2.2.1概念表達序列標(biāo)簽(expressed sequence tag,EST)是指基因序列中一段能特異地標(biāo)記或表征基因的序列，通常它含有足夠的結(jié)構(gòu)信息以顯示出該基因與其他基因的差異，長度一般為100～500bp。利用EST尋找新基因的一種策略即為表達序列標(biāo)簽法(ESTs)。現(xiàn)該法已成為快速分離克隆新基因的一種有效手段。該房法研究的是被轉(zhuǎn)錄的基因序列。,2024/3/21,第二節(jié) 目的基因的分離,88,2.2.2 基本步驟