紅平紅球菌復蘇促進因子基因克隆、表達及生物學活性研究.pdf

1、細菌活的非可培養(yǎng)（VBNC）狀態(tài)是細菌在不良環(huán)境下形成的一種休眠方式。在所在環(huán)境改善時非可培養(yǎng)細胞復蘇為可培養(yǎng)狀態(tài)，但有關細菌復蘇機制并不明確。藤黃微球菌（Micrococcus luteus）細胞復蘇促進因子（Resuscitation promoting factor,Rpf）首次被報道能促使休眠菌狀態(tài)細胞復蘇，并刺激正常細胞生長?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)復蘇促進因子（Rpf）廣泛存在于高G+C含量革蘭氏陽性細菌中，與細菌生長及抵御不良環(huán)境有關。不

2、同種類細菌的Rpf種類和數(shù)量有一定差異。紅球菌屬的細菌廣泛分布于巖石、土壤、地下水等自然環(huán)境。多數(shù)種類在修復石油污染土壤、污水處理等方面有有廣闊應用前景。紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolis）KB1分離自石油污染土壤，具有高效石油降解能力和環(huán)境適應性。為探索Rpf在紅平紅球菌適應環(huán)境中的作用，本文進行了紅平紅球菌KB1 Rpf基因克隆、基因結構分析、表達及生物學性質研究，具體內容如下：
　　設計了復蘇促進因

3、子基因特異引物，從紅平紅球菌KB1基因組DNA擴增出4種rpf基因，分別為564、1125、1128和555bp，編碼187、353、375和184個氨基酸殘基的蛋白質。序列分析發(fā)現(xiàn)4種rpf基因分別與藤黃微球菌rpf基因，結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）rpfB、rpfC及鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）rpfB有較高相似性。4個rpf基因編碼的蛋白都有一個類似藤黃微球菌細胞

4、復蘇促進因子的Rpf域，含有1個保守谷氨酸殘基，由大約70個氨基酸組成。其中Rpf-1與結核分枝桿菌、鏈霉菌RpfC相似，只含1個Rpf結構域，Rpf-2與結核分枝桿菌RpfB相似，含有1個Rpf域、1個G5域和2個DUF348，Rpf-3與鏈霉菌RpfB相似，含有1個Rpf域、G5域和3個DUF348，Rpf-4與藤黃微球菌Rpf相似，含1個Rpf域和1個LysM域。Rpf-2、Rpf-3含信號肽序列，Rpf-1、Rpf-4不含信號肽

5、。Rpf-1、Rpf-2、Rpf-3和Rpf-4均為親水性蛋白，含有多個絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸位點，沒有組氨酸位點。
　　設計特異表達引物，將紅平紅球菌KB1 rpf-1基因克隆于原核表達載體pET-32a(+)，在大腸桿菌BL21中高效表達，用Ni瓊脂糖親和層析柱純化重組蛋白，SDS-PAGE電泳分析表明純化蛋白分子量為36kDa。用人工合成底物4-Methylumbelliferyl-β-D-N-N’-N’-triacetyl

6、 chitotriose檢測發(fā)現(xiàn)rpf-1具有溶菌酶活性。溶菌酶比活力為2.07U/mg。以偶氮酪蛋白為底物測定了純化蛋白rpf-1的蛋白酶活性，發(fā)現(xiàn)純化蛋白能水解偶氮酪蛋白，蛋白水解酶比活力為235U/mg。
　　將純化的重組蛋白Rpf-1添加到不同狀態(tài)紅平紅球菌細胞培養(yǎng)物中，發(fā)現(xiàn)其對正常生長、VBNC狀態(tài)及-80℃低溫保存的細胞具有明顯復蘇或促生長作用。添加10%的Rpf-1使低溫保存紅平紅球菌生長速度增長4.8-6倍。添加R