細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水

1、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法,,《中國(guó)藥典》2010年版培訓(xùn)班,山東省藥品檢驗(yàn)所2010.10,主 要 內(nèi) 容,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查相關(guān)理論及概念《中國(guó)藥典》2010年版增修訂情況細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法及注意事項(xiàng),細(xì)菌內(nèi)毒素檢查相關(guān)理論及概念,細(xì)菌內(nèi)毒素 鱟試劑 鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)機(jī)理 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查,名詞解釋,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（Bacterial Endotoxins test）熱原檢查法（Pyrogen tes

2、t）LAL (Limulus amebocyte lysate) TestTAL (Tachypleus amebocyte lysate) TestLimulus Test,細(xì)菌內(nèi)毒素的發(fā)現(xiàn),細(xì)菌內(nèi)毒素這個(gè)概念在1890年的時(shí)候就已被提了出來，它是在研究發(fā)熱物質(zhì)過程所引成的，1933年Boivin最先由小鼠傷寒桿菌提取出來，進(jìn)行化學(xué)免疫學(xué)方面的研究，到1940年時(shí)候，Morgan使用志賀氏痢疾菌闡明了細(xì)菌內(nèi)毒素是由多糖脂質(zhì)及蛋白

3、質(zhì)三部分所組成的復(fù)合體，到了1950年以后，隨著生物學(xué)，物理化學(xué)，免疫學(xué)以及遺傳學(xué)等的進(jìn)步發(fā)展，細(xì)菌內(nèi)毒素的研究工作，尤其是其化學(xué)結(jié)構(gòu)組成及各種生物活性間的關(guān)系也更加明確起來。,Boivin：,Morgan：,內(nèi)毒素是由多糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體。脂多糖又由化學(xué)和生物性質(zhì)不同的特異O 抗原、核心多糖和類脂A（脂質(zhì)A） 組成。,內(nèi)毒素的多糖結(jié)構(gòu),細(xì)菌內(nèi)毒素參考品的建立,不同細(xì)菌的內(nèi)毒素對(duì)于鱟試劑的反應(yīng)活性不同，為保證鱟實(shí)驗(yàn)法的平行性和

4、重復(fù)性，要建立一種內(nèi)毒素的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為實(shí)驗(yàn)中的控制標(biāo)準(zhǔn)。由于大腸桿菌內(nèi)毒素在天然內(nèi)毒素中的致熱活性比較高，在各種細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)鱟試劑反應(yīng)的靈敏性上處于中值的位置，且其穩(wěn)定、可溶，因此一般都采用大腸桿菌的內(nèi)毒素作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素參考品。,標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素與環(huán)境內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素： 指經(jīng)人工提取精制并經(jīng)生物效價(jià)測(cè)定的細(xì)菌內(nèi)毒素，作為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的參考品。,國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（IS） 參考標(biāo)準(zhǔn)品

5、 （RSE） 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（NS/RSE） 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 工作標(biāo)準(zhǔn)品

6、 （CSE）,,,80年代以前以重量作為內(nèi)毒素的單位 1982年USP20引入以生物效價(jià)為量值的內(nèi)毒素單位（ EU， Endotoxin Unit）,細(xì)菌內(nèi)毒素的量值,CP2010年版規(guī)定內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶解后要在旋渦混合器上混合15分鐘，以后的每一步稀釋前要至少混合30秒，其他國(guó)家藥典也有類似要求；具有兩極活性的內(nèi)毒素分子在水中呈現(xiàn)不均勻分布 不按要求進(jìn)行旋渦混合會(huì)使所稀釋的內(nèi)毒素效價(jià)偏低，造成靈敏度標(biāo)示

7、偏高、陽性對(duì)照不凝等不正確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋,,鱟是一種海洋無脊椎動(dòng)物，藍(lán)色的血液。種類以及分布：美洲鱟：北美洲東岸海域中國(guó)鱟：中國(guó)東南沿海南方鱟：泰國(guó)和馬來群島海域圓尾鱟：東南亞西部海域,世界上現(xiàn)存鱟的種類,鱟試驗(yàn)的發(fā)現(xiàn),1956年Johns Hophins 大學(xué)動(dòng)物學(xué)家Frederik. Bang發(fā)現(xiàn)革蘭陰性細(xì)菌的粗制品能使鱟的血細(xì)胞凝聚。1963～1964年 Jack.Levin和Bang對(duì)細(xì)菌引起

8、鱟血凝聚進(jìn)行研究，用內(nèi)毒素和鱟血細(xì)胞溶解物證明鱟血凝聚機(jī)制是一種酶反應(yīng)。多位學(xué)者對(duì)鱟血細(xì)胞溶解物（LAL）進(jìn)行研究，闡釋了凝聚機(jī)制,鱟試劑：鱟血液變形細(xì)胞裂解物冷凍干燥制備而成鱟試劑的種類：依據(jù)鱟的種類分：美洲鱟試劑（LAL）中國(guó)鱟試劑（TAL）圓尾鱟試劑（CAL）依據(jù)檢查方法分：凝膠法鱟試劑和定量法鱟試劑依據(jù)內(nèi)毒素和鱟試劑反應(yīng)的專一程度分：普通鱟試劑和特異性鱟試劑,鱟試劑與分類,凝膠法鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)機(jī)理

9、 ——復(fù)雜的酶促反應(yīng)過程,BET的目的和前提,確保藥品不含有能導(dǎo)致患者發(fā)熱反應(yīng)發(fā)生的足量的細(xì)菌內(nèi)毒素。一定量的細(xì)菌內(nèi)毒素可以被人體耐受，也是SFDA允許的。 前提是假定引起發(fā)熱反應(yīng)的熱原幾乎全部是內(nèi)毒素。,二、2010年版《中國(guó)藥典》細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法增修訂情況,2010版與2005版區(qū)別修訂背景注射用藥品、生物制品建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法指導(dǎo)原則,2010版與2005版區(qū)別,,,,,,修訂背景,1、細(xì)菌內(nèi)毒素與檢查用水除了強(qiáng)調(diào)內(nèi)

10、毒素含量外，還強(qiáng)調(diào)應(yīng)對(duì)內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾作用。2、強(qiáng)調(diào)用干熱滅菌法（ 250℃、30分鐘以上）去除內(nèi)毒素與熱原法同步。3、根據(jù)某些藥（如抗腫瘤藥）用體表面積計(jì)算給藥量的需要，增加了按體表面積給藥時(shí)的計(jì)算方法。,注射用藥品、生物制品建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法指導(dǎo)原則,本原則依據(jù)2010年版藥典制訂，適用于注射用藥品、生物制品建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)目時(shí)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)及研究。,需建立內(nèi)毒素檢查項(xiàng)目的品種,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有家兔熱原檢查法需轉(zhuǎn)換為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

11、方法的品種。用于注射給藥，但未有熱原質(zhì)量控制的品種。注射用新藥需建立熱原質(zhì)量控制的品種。用于靜脈給藥的原輔料,建立方法時(shí)對(duì)鱟試劑及樣品的要求,同時(shí)使用兩個(gè)鱟試劑廠家的鱟試劑每個(gè)品種至少三批樣品（上市品種應(yīng)檢測(cè)兩個(gè)以上生產(chǎn)廠家；新藥需檢測(cè)連續(xù)生產(chǎn)的樣品）。,確定內(nèi)毒素限值,一般按公式L=K/M計(jì)算。M為人每公斤每小時(shí)臨床最大用藥劑量，依據(jù)藥品使用說明書，《臨床用藥須知》確定。兒童用藥如大于成人，以兒童為準(zhǔn)。為保障安全用藥，對(duì)于

12、抗感染、抗腫瘤、治療心血管疾病等重癥用的藥品、需聯(lián)合用藥的藥品，可根據(jù)計(jì)算值適當(dāng)調(diào)整，嚴(yán)格至計(jì)算限值的1/2或1/3。對(duì)于體積在100ml以上（包括100ml）的復(fù)方靜脈輸液類品種，內(nèi)毒素限值一般按0.5EU/ml計(jì)。其他單方靜脈輸液品種除另有規(guī)定外也可按用藥劑量計(jì)算，以EU/mg或EU/U表示。對(duì)于美國(guó)、歐洲或日本藥典已收載的，并已建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的品種可參考國(guó)外藥典規(guī)定的限值，與按公式計(jì)算出的數(shù)值比較，以嚴(yán)格者為該品種的限值

13、。如果使用的是國(guó)外藥典的限值，應(yīng)以最新版本藥典為準(zhǔn)。,干擾實(shí)驗(yàn),建議使用較低靈敏度鱟試劑 (0.5EU/ml或0.25EU/ml),以避免供試品中內(nèi)毒素的陽性影響。,三、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法,定義：本法系利用鱟試劑來檢測(cè)或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU)表示。,1、概述,凝膠法光度測(cè)定法 濁度法（終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)

14、濁度法） 顯色基質(zhì)法（終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法）,凝膠法,最簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用最廣泛，中國(guó)藥典的“仲裁”方法對(duì)干擾相對(duì)不敏感。有兩倍的誤差較光度測(cè)定法不靈敏,光度測(cè)定法,靈敏（動(dòng)態(tài)濁度檢測(cè)限0.001EU/ml，動(dòng)態(tài)顯色0.005EU/ml）檢測(cè)范圍寬（動(dòng)態(tài)濁度達(dá)到100EU/ml,動(dòng)態(tài)顯色50EU/ml）較之凝膠法易受干擾對(duì)結(jié)果的解釋更慎重。,實(shí)驗(yàn)基本流程圖,供試品,,限值確定,,最大有效稀釋倍數(shù)確定,,供試品干擾實(shí)

15、驗(yàn),,正式實(shí)驗(yàn),結(jié)果判斷,,2. 試劑、儀器設(shè)備等,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法所應(yīng)用的試劑，主要包括：鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品等。,國(guó)內(nèi)鱟試劑的生產(chǎn)情況,安度斯生物技術(shù)有限公司湛江海洋生物制品廠福州新北鱟試劑廠廈門鱟試劑廠福州東方鱟試劑廠福州平潭東方鱟試劑廠廣西北海鱟試劑廠,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 1.藥典規(guī)定： 凝膠法： < 0.015Eu/ml

16、 光度法： < 0.005Eu/ml 且對(duì)內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾作用 2. 和鱟試劑配套使用?,細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(RSE),細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)。,細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE),細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于試驗(yàn)中鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及各種陽性對(duì)照

17、。,儀器設(shè)備與實(shí)驗(yàn)器具,分析天平超凈工作臺(tái)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查專用干式恒溫器電熱恒溫干燥箱旋渦混合器,實(shí)驗(yàn)器具,試管架、鑷子、消毒棉球、稱量瓶(30mm×60mm)、刻度吸管(1、2、5、10、15ml)、各種試管、中號(hào)金屬飯盒、加樣器等。目前已有多種無熱原的一次性用品,實(shí)驗(yàn)器具的洗滌與除內(nèi)毒素,實(shí)驗(yàn)中所使用的玻璃儀器清潔與否，直接影響試驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中使用的所有玻璃器具一般經(jīng)洗液浸泡后，取出用自來水、 純化水依次沖洗干凈

18、（可用純化水浸泡）。,實(shí)驗(yàn)器具的洗滌與滅菌,試驗(yàn)中所用的器皿，需要經(jīng)過處理，除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是250℃干烤至少30分鐘，達(dá)到規(guī)定時(shí)間后，關(guān)斷電源，待烤箱溫度自然降至室溫，一般約需6～8 小時(shí)。將沖洗干凈的試管、稱量瓶、玻璃小瓶置金屬飯盒內(nèi)，吸管置金屬筒內(nèi)，放入烤箱，于250℃干烤至少30分鐘，放冷，密閉保存?zhèn)溆?。滅菌后的?shí)驗(yàn)器具應(yīng)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)使用。,實(shí)驗(yàn)器具的洗滌與滅菌,也可用其他適宜的方法，并應(yīng)確證不干擾細(xì)菌

19、內(nèi)毒素的檢查。除去外源性內(nèi)毒素的玻璃器皿應(yīng)在規(guī)定內(nèi)使用，否則須再次除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。試驗(yàn)操作過程應(yīng)防止微生物和內(nèi)毒素的污染。,3.供試品溶液的配制,按各藥品項(xiàng)下規(guī)定，取供試品，精密稱定于稱量瓶(事先已除去外源性內(nèi)毒素)中，按其效價(jià)或含量，用各藥品項(xiàng)下規(guī)定的稀釋劑稀釋至規(guī)定濃度，充分搖勻使完全溶解，放置 5～10分鐘，再搖勻,放置備用。,3.供試品溶液的配制,一般要求供試品溶液的pH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)。對(duì)于過酸、過堿

20、或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測(cè)溶液的pH值，可以使用酸、堿溶液或適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH值。酸或堿溶液須用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水在已經(jīng)去除內(nèi)毒素的容器中配制，緩沖液必須經(jīng)過驗(yàn)證不含內(nèi)毒素或干擾因子。,3.供試品溶液的配制,注意事項(xiàng)：1、供試品溶液的濃度如以 **mg/ml表示，此**mg/ml是指供試品溶液中活性物質(zhì)的濃度。2 、樣品初試時(shí)一般按照樣品的估計(jì)百分含量或效價(jià)單位計(jì)算稀釋液溶劑加入量，復(fù)試時(shí)，則必須根據(jù)該供試品的實(shí)際百分含

21、量或效價(jià)來計(jì)算。3.考慮供試品本身的體積,4. 內(nèi)毒素限值的確定,內(nèi)毒素限值 L=K/M 每小時(shí)靜注入人體內(nèi)，不引起熱原反應(yīng)的最大內(nèi)毒素劑量（閾值） K=5EU/（kg·h）L 為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg 或EU/U（活性單位）表示；K 為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量,以EU/ （kg·h）表示，注射劑K=5EU/（kg·h），放射性藥品注射劑K=2.

22、5EU/（kg·h），鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/（kg·h）。,,M 為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均體重按60kg 計(jì)算，人體表面積按1.62m2計(jì)算。注射時(shí)間若不足1 小時(shí)，按1 小時(shí)計(jì)算。按人用劑量計(jì)算限值時(shí)，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際情況做必要調(diào)整，但需說明理由。,內(nèi)毒素限值,大輸液

23、K=0.5EU/ml注射用水 K=0.25 EU/ml注意M一定要找到最大量，如果有兒童用量，按體重計(jì)一般高于成人量,內(nèi)毒素限值,大部分藥品的內(nèi)毒素限值=k/最大給藥劑量（mg/kg）假如劑量為14.3mg/kg， 內(nèi)毒素限值=5/14.3=0.35EU/mg 假如此產(chǎn)品的濃度為100mg/ml 內(nèi)毒素限值=0.35?100=35EU/ml,5.凝膠法鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任

24、何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。,5、鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),鱟試劑的標(biāo)示靈敏度：在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，其單位用EU/ml表示。,5、鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),1、取細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用75%酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。,5、鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),2、將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用

25、水溶解 ，在旋渦混合器上混勻15分鐘 ，然后根據(jù)鱟試劑標(biāo)示靈敏度(λ)，制成 2λ、λ、0.5λ和0.25λ4個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘。,5、鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),3、取鱟試劑，用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用75％酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。將鱟試劑按標(biāo)示裝量復(fù)溶，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。取 0.1ml/支的鱟試劑18支備用 （規(guī)格大于 0.1ml／支的鱟試劑按其

26、標(biāo)示量加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶后分裝）。,5、鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),4、按檢查法項(xiàng)下試驗(yàn)，將待復(fù)核的鱟試劑18管放在試管架上，排成5列，4列4管，1列2 管，其中前4列分別加入4個(gè)不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1ml（每1個(gè)內(nèi)毒素濃度平行做4管），另一列2管加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水0.1ml。加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，垂直放入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查專用干式恒溫儀中，在37℃±1℃保溫60分鐘±2分鐘后，

27、觀察并記錄結(jié)果。,5、鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),5、試驗(yàn)結(jié)果中，如最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度 0.25λ管均為陰性，陰性對(duì)照均為陰性，按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值(λc)。 λc＝antilg(ΣX/4) 式中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值(lg)。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽性結(jié)果的濃度。,5、鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),6、當(dāng)λc在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2

28、λ) 時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。,結(jié)果判斷,上圖：陽性,下圖：陰性,6、供試品的干擾試驗(yàn),當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或無內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。當(dāng)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。,,干擾試驗(yàn)實(shí)際上是兩個(gè)鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)： 一個(gè)真正的鱟試劑靈敏度復(fù)核 一個(gè)“鱟試劑靈敏度復(fù)

29、核”試驗(yàn)是用一定濃度的供試品溶液替代BET水（鱟試劑復(fù)溶仍采用BET水）。也就是說“用供試品溶液將同一支細(xì)菌內(nèi)素素標(biāo)準(zhǔn)品制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ4個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液”,進(jìn)行干擾試驗(yàn)一般步驟：,供試品限值確定根據(jù)鱟試劑的靈敏度范圍確定MVD范圍（供試品溶液濃度范圍）預(yù)試驗(yàn)（初篩試驗(yàn)）確定樣品最大不干擾濃度正式干擾試驗(yàn),預(yù)試驗(yàn),通過一系列含有標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度為2λ的供試品溶液與后試劑反應(yīng)，初步篩選出不干擾的濃度范圍。前提

30、：供試品對(duì)內(nèi)毒素檢查的干擾多數(shù)為抑制目的：避免干擾試驗(yàn)的盲目性,6、供試品的干擾試驗(yàn),1、按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水和未檢出內(nèi)毒素的供試品溶液且不超過最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)的溶液，分別制成含細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品2λ、λ、0.5λ和0.25λ 4個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液系列C和B。,凝膠法干擾試驗(yàn)溶液的制備,* 注：稀釋倍數(shù)是指內(nèi)毒素濃度，而其中供試品濃度是不變的,6、供試品的干擾試驗(yàn),2、鱟試劑的準(zhǔn)備： 36支

31、3、按檢查法項(xiàng)下試驗(yàn)，照表一制備溶液A、B、C和D。 將準(zhǔn)備好的18管鱟試劑放在試管架上，排成5列， 1 列2管作為A，4列4管作為B，其中4列分別加入4個(gè)不同濃度的含供試品的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，另一列加入供試品溶液。,6、供試品的干擾試驗(yàn),將準(zhǔn)備好的另外18管鱟試劑放在試管架上，排成5列，4列4管作為C，1列2管作為D，其中4列分別加入 4個(gè)不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，另一列加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕混勻，避免

32、產(chǎn)生氣泡，垂直放入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查專用干式恒溫儀中，在37℃±1℃保溫60分鐘±2分鐘后，觀察并記錄結(jié)果。,,,6、供試品的干擾試驗(yàn),4、試驗(yàn)結(jié)果中，只有當(dāng)溶液A和陰性對(duì)照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度符合范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算系列溶液C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值(Es和Et)。,6、供試品的干擾試驗(yàn),Es＝antilg(ΣXs/4)Et＝antilg(ΣXt/4)

33、 式中Xs、Xt分別為系列溶液C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值(lg)。,6、供試品的干擾試驗(yàn),當(dāng)Es在0.5λ～2λ (包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es～2Es(包括0.5Es和2Es) 時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過MVD的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗(yàn)。,6、供試品的干擾試驗(yàn),供試品的最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)按下式計(jì)算：MVD＝CL/λ式中：

34、L：為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值。 C：為供試品溶液的濃度（抗生素樣品濃度以活性成分計(jì)）。當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，C為1.0ml/ml，當(dāng)L以EU/mg、EU/u表示時(shí)，C為mg/ml、 u/ml。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD取1，可計(jì)算供試品的最小有效稀釋濃度C=λ/L。 λ：鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（EU/ml）。,7、凝膠限度試驗(yàn),A為供試品溶液；B為供試品陽性對(duì)照；C為陽性對(duì)照；D為陰性對(duì)照,7、凝膠

35、限度試驗(yàn),1. 供試品溶液的配制用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將供試品配成對(duì)應(yīng)MVD的濃度。2 陽性對(duì)照液的制備：用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成 2λ濃度的內(nèi)毒素溶液。,7、凝膠限度試驗(yàn),3 供試品陽性對(duì)照液的制備：用被測(cè)供試品溶液將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成 2λ濃度的內(nèi)毒素溶液。實(shí)際工作中 一般采用2倍MVD的供試品溶液和4λ的內(nèi)毒素溶液等體積混合的方法配制，因此供試品稀釋過程要有2MVD和MVD兩個(gè)濃度，內(nèi)毒素標(biāo)

36、準(zhǔn)品稀釋要有4λ和2λ兩個(gè)濃度,7、凝膠限度試驗(yàn),4 將8管鱟試劑放置在試管架上，其中2支加入 0.1ml按最大有效稀釋倍數(shù)稀釋的供試品溶液作為供試品管， 2支加入 0.1ml陽性對(duì)照液作為陽性對(duì)照管，2支加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照，2支加入0.1ml供試品陽性對(duì)照溶液作為供試品陽性對(duì)照管。,7、凝膠限度試驗(yàn),5 加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，垂直放入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查專用干式恒溫儀中，在37℃&#

37、177;1℃保溫 60分鐘±2分鐘后，觀察并記錄結(jié)果。注意在保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到震動(dòng)制成假陰性結(jié)果。,7、凝膠限度試驗(yàn),6 結(jié)果判斷將試管從恒溫儀中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn) 180°時(shí)，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為(＋) ；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)，變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為(－)。若陰性對(duì)照溶液的平行管均為陰性，供試品陽性對(duì)照溶液的平行管均為陽性，陽性對(duì)照溶液的平行管

38、均為陽性，試驗(yàn)有效。,7、凝膠限度試驗(yàn),結(jié)果判斷供試品2管均為(－)，應(yīng)認(rèn)為符合規(guī)定。如2管均為(＋)，應(yīng)認(rèn)為不符合規(guī)定；如2管中1管為(＋)，1管為(－)，按上述方法另取4支供試品管復(fù)試，若所有平行管均為(-)，即認(rèn)為符合規(guī)定。否則判供試品為不符合規(guī)定。,凝膠法限量檢查,美國(guó)藥典和歐洲藥典溶液A和供試品陽性對(duì)照液B使用不超過MVD的供試品溶液……USP32: Prepare Solution A and positive pro

39、duct control Solution B using a dilution not greater than the MVD …… EP 6.0: Prepare solution A and solution B (positive product control) using a dilution not greater than the MVD……,8、凝膠半定量試驗(yàn),凝膠半定量試驗(yàn)系通過確定反應(yīng)終點(diǎn)濃度來量化供試品中內(nèi)毒

40、素的含量。按下表制備溶液A、B、C、D。按照鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。,8、凝膠半定量試驗(yàn),8、凝膠半定量試驗(yàn),注：A為不超過MVD并且通過干擾試驗(yàn)的供試品溶液。從通過干擾試驗(yàn)的稀釋倍數(shù)開始用檢查用水稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀釋不得超過MVD。B為2λ濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液A（供試品陽性對(duì)照）。C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列。D為陰性對(duì)照。,8、凝膠半定量試驗(yàn),結(jié)果判斷1、若陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，供試品

41、陽性對(duì)照溶液B的平行管均為陽性，系列溶液C的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.5λ～2λ之間，試驗(yàn)有效。,8、凝膠半定量試驗(yàn),系列溶液A中每一系列平行管的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以λ，為每個(gè)系列的反應(yīng)終點(diǎn)濃度，所有平行管反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度[按公式CE=antilg(∑X/2)] 。如果檢測(cè)時(shí)采用的是供試品的稀釋液，則計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時(shí)要將結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。,8、凝膠半定量試驗(yàn),如試驗(yàn)中供試品溶液的所有平行管均為陰

42、性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于λ（如果檢驗(yàn)的是稀釋過的供試品，則記為小于λ乘以供試品進(jìn)行半定量試驗(yàn)的初始稀釋倍數(shù)）。如果供試品溶液的所有平行管均為陽性，應(yīng)記為內(nèi)毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以λ。,8、凝膠半定量試驗(yàn),若內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限值，判供試品符合規(guī)定。若內(nèi)毒素濃度大于或等于規(guī)定的限值，判供試品不符合規(guī)定。,細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢查法,,發(fā)展現(xiàn)狀,我國(guó)2000版藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則正式列入，定量法在我國(guó)得到肯定、應(yīng)用和推

43、廣。2005版將2000年版的指導(dǎo)原則合并入檢查法中，正式收載細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)法（光度測(cè)定法）。,分類,終點(diǎn)濁度法 濁度法 光度測(cè)定法 動(dòng)態(tài)濁度法（定量法） 終點(diǎn)顯色法 顯色基質(zhì)法

44、 動(dòng)態(tài)顯色法,,,,濁度法,原理：利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)機(jī)理，被激活的凝固酶切斷凝固蛋白原中特定位置的精氨酸肽鏈，形成凝固蛋白，產(chǎn)生濁度變化，用適當(dāng)濁度儀進(jìn)行定量分析的一種方法。,,根據(jù)檢測(cè)原理，可分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。終點(diǎn)濁度法是依據(jù)反應(yīng)混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)的濁度（吸光度或透光率）

45、之間存在著量化關(guān)系來測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測(cè)濁度增加速度的方法。,顯色基質(zhì)法,原理：利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)被內(nèi)毒素激活的凝固酶水解鱟三肽中精氨酸肽鏈，釋放出對(duì)硝基苯胺（PNA)，用冰醋酸終止反應(yīng)進(jìn)行吸光度測(cè)定，或用游離的PNA和偶氮試劑反應(yīng)，最終形成偶氮藍(lán)復(fù)合物顯色而進(jìn)行比色測(cè)定

46、的一種方法。,,根據(jù)檢測(cè)原理，分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法。終點(diǎn)顯色法是依據(jù)反應(yīng)混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出的呈色團(tuán)的量之間存在的量化關(guān)系來測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的色度達(dá)到某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測(cè)色度增長(zhǎng)速度的方法。,內(nèi)毒素與鱟試劑的凝膠反應(yīng),,,,光密度OD,時(shí)間（分鐘）,不同濃度的內(nèi)毒素反應(yīng)曲線,鱟試劑定量檢測(cè)內(nèi)毒素原理,檢測(cè)樣品原理,動(dòng)態(tài)濁度法實(shí)驗(yàn)方法,1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的可

47、靠性實(shí)驗(yàn): r絕對(duì)值≥0.9802.供試品的干擾實(shí)驗(yàn): MVD=L.C/λ1 測(cè)定及判斷: 回收率50%-200%3.供試品的定量測(cè)定：測(cè)定結(jié)果與L比較,實(shí)驗(yàn)器材,微量移液器，配套的除熱原玻璃吸頭儀器專用的比濁玻璃小試管和稀釋樣品的大玻璃試管旋渦混旋器封口膜及試管架定量檢測(cè)儀檢查用水鱟試劑,,加樣后搖勻，用封口膜封好，立即插入儀器,加入鱟試劑,,,陰性對(duì)照,樣品,陽性對(duì)照,標(biāo)準(zhǔn)曲線,當(dāng)使用新批號(hào)

48、的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)。 用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素配成溶液，并制成至少3個(gè)濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測(cè)限。每一稀釋步驟的混勻時(shí)間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管。同時(shí)要求做2支陰性對(duì)照。當(dāng)陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。,標(biāo)準(zhǔn)曲線,內(nèi)毒素含量濃度與反應(yīng)時(shí)間 濃度與反應(yīng)時(shí)間分別取對(duì)數(shù)后

49、將兩組數(shù)據(jù)用最小二乘法統(tǒng)計(jì)能夠擬合出直線：標(biāo)準(zhǔn)曲線,,,,LgT=a+b LgC,內(nèi)毒素濃度C,反應(yīng)時(shí)間T,10倍稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線,例：把內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為10 EU/ml ，1 EU/ml ，0.1 EU/ml ，0.01EU/ml四個(gè)濃度優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)范圍寬，線性好，易操作。缺點(diǎn)：相對(duì)于對(duì)倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性稍差。,2倍稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線,例：把內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0.5 EU/ml ，0.25EU/ml ，0.125 EU/ml ，

50、0.0625EU/ml，0.03125 EU/ml 五個(gè)濃度。優(yōu)點(diǎn)：數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性好。缺點(diǎn)：曲線范圍窄，線性稍差，初學(xué)者不易于操作。,理想標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)價(jià),最少有四個(gè)連續(xù)濃度梯度點(diǎn)。相關(guān)系數(shù) 。標(biāo)準(zhǔn)品回收率應(yīng)在100±25%。每個(gè)點(diǎn)至少2個(gè)平行管，平行管的變異系數(shù)不應(yīng)大于10%。連作3條標(biāo)準(zhǔn)曲線的合并后，仍滿足以上條件可以存檔供日常檢測(cè)。,光度測(cè)定法干擾試驗(yàn)溶液的制備,,A為稀釋倍數(shù)不超過MVD的供試品溶液。B為加入標(biāo)準(zhǔn)

51、曲線中點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的一個(gè)已知濃度內(nèi)毒素的，且與溶液A有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液；C為如“標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)”項(xiàng)下描述的，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液；D為陰性對(duì)照。,供試品干擾試驗(yàn),供試品限值的確定：L=K/M最大有效稀釋倍數(shù)的確定：MVD=CL/λ（標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)濃度）通過檢測(cè)從MVD到較高濃度的供試品溶液（可以到原液），計(jì)算回收率，判斷供試品干擾情況。R=(Cs - Ct)/ λm ×100%干擾試驗(yàn)的