細菌內(nèi)毒素檢查方法建立中應(yīng)注意的幾個問題

1、細菌內(nèi)毒素檢查方法建立中應(yīng)注意的幾個問題摘要：本文對細菌內(nèi)毒素檢查方法的建立、限值的確定、方法學(xué)驗證及常見問題進行了介紹。在建立細菌內(nèi)毒素檢查法之前，應(yīng)盡可能多的收集有關(guān)該藥品的基本信息，例如：有關(guān)樣品的溶解性信息，推薦的稀釋液，在水中的溶解度，以及最適溶劑；樣品的pH范圍；分子量大??；產(chǎn)品規(guī)格、體積或重量；擬用于臨床的用法和用量等等。以便選擇合適的樣品處理方法和內(nèi)毒素檢查方法，對于早期研發(fā)階段的藥物，應(yīng)選擇合適的賦形劑，以有利于細菌內(nèi)

2、毒素檢查中對樣品的稀釋處理。此外，在確定內(nèi)毒素限值時還應(yīng)盡可能采用最大人擬用劑量，為臨床安全性和有效性研究中增加劑量留出空間。一、細菌內(nèi)毒素檢查方法建立的主要步驟對某一新化合物建立細菌內(nèi)毒素檢查方法時，首先應(yīng)根據(jù)人體最大日給藥劑量和給藥途徑，計算和確定樣品的內(nèi)毒素限值，選擇合適的鱟試劑，根據(jù)臨床規(guī)格，計算最大有效稀釋倍數(shù)，稀釋產(chǎn)品，并在低于最大稀釋倍數(shù)的濃度下進行檢查?？梢圆捎媚z法，也可以采用終點法或動態(tài)法。當(dāng)測定結(jié)果有爭議時，除另有

3、規(guī)定外，以凝膠法為準。1、細菌內(nèi)毒素限值的確定一個藥品在投放市場前，它是否滿足內(nèi)毒素限值的要求？樣品的內(nèi)毒素含量具體是多少？這些問題不但關(guān)注用藥安全，還應(yīng)該最大限度的提供有關(guān)內(nèi)毒素含量的準確信息，為藥品生產(chǎn)過程中質(zhì)量控制提供警戒信息。盡管細菌內(nèi)毒素檢查方法的建立是一個科學(xué)方法的研究過程，但其最終目的還是要為控制藥品質(zhì)量服務(wù)。因此，在方法建立時，不但要闡明限值的合理性，考慮技術(shù)可能達到的限值，同時還要滿足相關(guān)藥品管理法規(guī)的要求。研究人員在

4、建立方法的早期，一般會按照臨床建議的最大人用劑量確定一個非正式的限值，這個限值可以根據(jù)實驗室可以達到的最低檢測水平，把限值訂的相對比較嚴格，但往往由于早期的臨床劑量會比最終上市的臨床劑量高幾倍，所以嚴格的限值，可能會使得正式生產(chǎn)時很多產(chǎn)品不能通過檢查，從而造成不必要的浪費；因此參按照法規(guī)允許的最高水平，酌情確定樣品的限值。樣品內(nèi)毒素限值的確定一般與臨床人體最大給藥劑量有關(guān)，劑量越大，單位重量或體積的內(nèi)毒素限值越低。一般按以下公式計算：內(nèi)

5、毒素限值L=KM。式中內(nèi)毒素限值L是以EUml、EUmg或EUu表示；K為按規(guī)定的給藥途徑，人體每公斤體重每小時最大可耐受的內(nèi)毒素劑量，以EU（kg.h）表示，注射劑K=5EU（kg.h），其中放射性藥品注射劑K=2.5EU（kg.h），鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU（kg.h）。一般我國人群平均體重按60kg計算，人體對細菌內(nèi)毒素的最大耐受量為300EUh；另我國人體的平均體表面積按1.55m2計算，人體每平方米的最大耐受劑量為(300E

6、Uh)1.55m2=（193EUh）m2。M為人體每公斤體重每小時接受的最大給藥劑量，以ml（kg.h）、mg（kg.h）或u（kg.h）表示。內(nèi)毒素限值計算舉例（一）：A注射劑的人體最大用量為每小時1.5g，每公斤每小時體重的劑量為1.5g60kg=0.025gkg=25mgkg，內(nèi)毒素限值L=KM=(5EUkg)(25mgkg)=0.2EUmg。在細菌內(nèi)毒素檢查法中，細菌內(nèi)毒素標準品和鱟試劑常常以EUml表示，所以在具體實驗中樣品的

7、內(nèi)毒素的限量可以轉(zhuǎn)換為EUml的表示方法，可使實驗操作計算更為方便。假定產(chǎn)品A的濃度為100mgml（或原料藥經(jīng)溶解后的濃度為100mgml）那么，將產(chǎn)品A的限值從EUmg轉(zhuǎn)變?yōu)镋Uml時，內(nèi)毒素限值L=0.2EUmg100mgml=20EUml。內(nèi)毒素限值計算舉例（二）：B注射劑的臨床最大用藥劑量為1gm2，規(guī)格為50mgml，內(nèi)毒素限值L=（193EUm2）（1gm2）=193EUg=0.193EUmg，轉(zhuǎn)換為EUml表示時，L=M

8、VD，從而檢測不到污染的樣品。因此，采用合并樣品進行試驗時，MVD應(yīng)降低，這種情況下的MVD等于原來的MVD除以合并樣品的數(shù)量。例如：假定鱟試劑的標示靈敏度λ為0.125EUml，樣品的MVD為100（倍）。預(yù)試驗結(jié)果表明樣品在1：8倍稀釋時，具有抑制作用，不干擾濃度（NIC）為1:16，可選擇用于驗證試驗的稀釋度或濃度為最低不小于1:32，可以選擇1:64。4、方法學(xué)驗證試驗（增強抑制試驗）驗證試驗在細菌內(nèi)毒素方法學(xué)的建立過程中具有十

9、分重要的作用，主要目的是確證檢測內(nèi)毒素的方法是否受樣品的干擾。驗證試驗的特點是樣品濃度保持不變，添加內(nèi)毒素的濃度逐漸降低。在建立細菌內(nèi)毒素檢查方法中，驗證試驗前，要去除樣品可能含有的內(nèi)毒素，以確保建立方法的準確可靠。凝膠法的驗證試驗是通過在細菌內(nèi)毒素檢查用水和樣品溶液中平行進行鱟試劑標示靈敏度的復(fù)核試驗完成，試驗中要求樣品平行4管，設(shè)立樣品陰性對照管，也同樣平行4管。盡管要求添加內(nèi)毒素標準平行管數(shù)量各國不完全一致，可以2管，也可以4管，

10、但鑒于目前國內(nèi)的具體情況，在2005年版藥典附錄的細菌內(nèi)毒素檢查法中規(guī)定是平行4管。細菌內(nèi)毒素檢查用水和樣品溶液中的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)平均值（內(nèi)毒素含量）必須在鱟試劑標示靈敏度的2倍范圍以內(nèi)，在樣品溶液和細菌內(nèi)毒素檢查用水中的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)平均值也應(yīng)相互在2倍范圍之內(nèi)（2λ~0.5λ）。光度法的驗證試驗中，要求陰性對照所含有的內(nèi)毒素必須明顯低于標準內(nèi)毒素曲線中的最小濃度，陽性對照的內(nèi)毒素回收率，在扣除樣品可能含有的內(nèi)源性內(nèi)毒素后，必