免疫熒光檢查

1、,歡迎各位同仁,光 臨,,,免疫熒光技術(shù)在某些皮膚病中 的 應(yīng) 用主講人：周桂芝,概 述,抗原與相應(yīng)的抗體接觸后，立即結(jié)合而形成不易分離的抗原抗體復(fù)合物。在結(jié)合之前，先使抗體（或抗原）與某些顯色劑偶聯(lián)，則形成的抗原抗體復(fù)合物由不可見(jiàn)成為可見(jiàn)，從而可以確定組織中是否存在某種抗原（或抗體），這就是免疫病理技術(shù)的基本原理。根據(jù)抗體（或抗原）標(biāo)記物的不同分為免疫熒光技術(shù)和免疫酶標(biāo)技術(shù)。,免疫熒光技術(shù)的發(fā)展,· 1941年

2、由Coons首先建立了免疫熒光技術(shù) · 1961年 由Kaskin首先將該技術(shù)應(yīng)用到皮膚科 · 1963年 Burnham等報(bào)告了紅斑狼瘡病人表皮、 真皮間基底膜IgG、C3沉積 · 1964年 Beutner和Jordon利用免疫熒光技術(shù)研究天皰瘡 · 1967年 區(qū)分出大皰性類天皰瘡 · 70年代開(kāi)始應(yīng)用免疫電鏡去認(rèn)識(shí)大皰性皮膚病,,近來(lái)，皮膚病理工作者應(yīng)

3、用免疫熒光技術(shù)對(duì)大皰性皮膚病、紅斑狼瘡、扁平苔癬、銀屑病、皮膚血管炎等免疫病理特征進(jìn)行了研究，并已廣泛應(yīng)用于常規(guī)病理診斷、鑒別診斷及指導(dǎo)治療。,,缺點(diǎn)：（1）標(biāo)記的熒光極易褪色，不能長(zhǎng)久保存。（2）影響熒光強(qiáng)度的因素很多，而且判斷陽(yáng)性熒光與非特異性熒光有一定的主觀性。（3）陽(yáng)性熒光細(xì)胞無(wú)法與常規(guī)石臘切片對(duì)照觀察，組織學(xué)定位困難。（4）需要較好的冰凍切片機(jī)和熒光顯微鏡等，因此它的應(yīng)用受到一定的限制。,免疫熒光技術(shù),（一）原理：

4、 將熒光色素（異硫氰酸熒光素）與特異性抗體以化學(xué)的方法結(jié)合起來(lái)，即為熒光抗體，再用這種熒光抗體作為一種試劑，在特定的條件下浸染標(biāo)本，與標(biāo)本中相應(yīng)的抗原結(jié)合。在組織中形成含有熒光標(biāo)記的抗體—抗原復(fù)合物，再用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本。,,（二）方法： 1、直接法（DIF）：用熒光素標(biāo)記的特異性抗體來(lái)檢查未知抗原。如組織中存有相應(yīng)的抗原，便結(jié)合，形成復(fù)合物。

5、 抗原 標(biāo)記抗體 玻片 標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,優(yōu)點(diǎn)：（1）方法簡(jiǎn)單，需時(shí)短。（2）特異性強(qiáng)。 缺點(diǎn)：（1）不能用

6、已知抗原檢查未知抗體。（2）為了檢查各種抗原，需要準(zhǔn)備多種特異性熒光抗體。（3）敏感性較差。,,2、間接法（IIF）：用熒光標(biāo)記的抗體來(lái)檢查未知抗原或未知抗體。 抗原 抗原抗體

7、 復(fù)合物 未標(biāo)記抗體 玻片 抗原抗體復(fù)合物 標(biāo)記抗體 雙抗體復(fù)合物,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

8、,,,,,,,,優(yōu)點(diǎn)：（1）既能檢查未知抗原，也能檢查未知抗體。（2）用一種標(biāo)記抗體，能檢查多種抗體復(fù)合物。（3）敏感性高。 缺點(diǎn)：（1）由于參加的因素多，受干擾的機(jī)會(huì)也多，故結(jié)果有時(shí)判斷困難。（2）方法較麻煩，時(shí)間較長(zhǎng)。,,3、補(bǔ)體熒光抗體法：用熒光素標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體檢測(cè)未知抗原或未知抗體。

9、 抗原+抗體 +補(bǔ)體

10、 復(fù)合物 抗原 抗體 補(bǔ)體 抗原+抗體+補(bǔ)體復(fù)合物 抗補(bǔ)體標(biāo)記抗體 熒光標(biāo)記補(bǔ)體復(fù)合物,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,優(yōu)點(diǎn)：

11、 具有間接法的一些優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)： 非特異性熒光更多。,在皮膚病中的應(yīng)用,免疫熒光檢查，對(duì)某些皮膚病已成為一種極重要的臨床和組織學(xué)檢查的補(bǔ)充方法，既能檢查血清，又能檢查活體標(biāo)本。,（一）標(biāo)本,1、血清標(biāo)本：取血2ml，不加抗凝劑，室溫下放置片刻，凝固 離心 分離出血清 冷凍保存。 2、皮膚活檢標(biāo)本：進(jìn)行皮膚活檢時(shí)，其所取標(biāo)本部位的選擇十分重要，直接關(guān)系到免疫病理的結(jié)果如何。,

12、,,,,皮膚病免疫熒光,,,,,（二）皮膚病,1、紅斑狼瘡：在目前紅斑狼瘡的診斷和研究中，直接免疫熒光（DIF）已成為一種重要的手段。 （1）狼瘡帶試驗(yàn)（LBT）：用直接免疫熒光法來(lái)確定DLE皮損，SLE皮損及正常皮膚的表皮、真皮交界處免疫球蛋白和補(bǔ)體的沉積。一般沉積抗體是以IgM、IgG、C3為主，IgA少，呈線狀或帶狀或顆粒狀。有時(shí)真皮內(nèi)血管壁上可有IgG、IgM沉積。,（2）LBT診斷價(jià)值：,①LBT是診斷LE的重要檢測(cè)方

13、法，具很高的特異性，SLE皮損部位LBT陽(yáng)性率為90%，未受累皮膚為54%，DLE皮損處為90%。如果LBT（+）可以確診LE，因此能將臨床上與LE相似的其他皮膚病鑒別。但是LBT（-）也不能排除LE，因LE患者的LBT不是百分之百的陽(yáng)性。,,②LBT可用于SLE與DLE的鑒別診斷。 ③對(duì)無(wú)皮損的SLE，LBT有助于診斷。 ④LBT對(duì)SLE與其他抗核抗體陽(yáng)性疾病作鑒別時(shí)，具有參考價(jià)值。 ⑤狼瘡帶假陽(yáng)性。,,狼瘡帶對(duì)治療

14、敏感，經(jīng)大約6個(gè)月治療后，LBT可轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮裕ㄑ獌?nèi)抗體陰轉(zhuǎn)可很快，但皮損內(nèi)抗體消失慢），SLE病情加重LBT由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。（Ig沉積在基底細(xì)胞的半橋粒、基底板內(nèi)及真皮內(nèi)的纖維成份中）,,2、天皰瘡： DIF 患者幾乎百分之百均可查到表皮細(xì)胞間抗體，呈魚(yú)網(wǎng)狀沉積，主要為IgG，約30—50%病人可有IgM、IgA。未治療的病人伴C3。紅斑型天皰瘡除了在表皮出現(xiàn)細(xì)胞間IgG抗體外，23-80%的病人伴有基底膜抗體沉積。

15、,,IIF 查病人血清，約80—90%天皰瘡病人有循環(huán)的抗表皮細(xì)胞間抗體，主要是IgG。病人血清中抗細(xì)胞間抗體的滴度與病情的活動(dòng)性有密切關(guān)系?？贵w滴度1:20—1:40為低滴度，1:80—1:160為中等滴度，1:320以上為高滴度。應(yīng)每2-3周做一次IIF，直至病情減輕，以后每3—6個(gè)月復(fù)查一次。,,IgA天皰瘡： 為表皮內(nèi)嗜中性細(xì)胞增多，臨床表現(xiàn)為角層下膿皰病樣皮膚病和皰疹樣天皰瘡，免疫病理為表皮細(xì)胞間IgA沉

16、積，少數(shù)病人伴IgG、C3沉積。僅為細(xì)胞間IgA沉積或主要為IgA，那么IgA天皰瘡診斷成立。50%的病人有循環(huán)IgA抗體結(jié)合在表皮細(xì)胞間，但滴度低。,,副腫瘤型天皰瘡： 伴惡性疾病特征，常伴腫瘤為非何杰金氏淋巴瘤，慢性淋巴細(xì)胞白血病、腸腺瘤等，皮損為多形性瘙癢性丘疹、鱗屑，水皰，有時(shí)似多形紅斑，組織學(xué)為表皮基底層上棘層松懈，角質(zhì)形成細(xì)胞壞死，角化不良，表現(xiàn)為天皰瘡和多形紅斑的特征，DIF 細(xì)胞間Ig

17、G+，伴有或不伴有C3沉積，同時(shí)基底膜有C3或IgG沉積。IIF 有抗表皮細(xì)胞間抗體和抗基底膜抗體。,,3、大皰性類天皰瘡（BP） DIF 在皮損周圍的皮膚基底膜有線狀I(lǐng)gG（95%），C3（100%）沉積，陽(yáng)性率為95%--100%。少數(shù)病人可有IgM沉積。（沉積在透明板和基底細(xì)胞下方） IIF 約70—80%病人血清中有IgG抗基底膜循環(huán)抗體?？贵w滴度與病情活動(dòng)性之間似無(wú)明顯關(guān)系。,,4、&

18、#160; 皰疹樣皮炎（DH） DIF 非受損皮膚真皮乳頭部有顆粒狀I(lǐng)gA沉積。陽(yáng)性率為95%，抗體沉積最常見(jiàn)為顆粒型，而連續(xù)線型少見(jiàn)。個(gè)別病人除IgA沉積外還伴有C3沉積。（顆粒狀I(lǐng)gA沉積在真皮乳頭彈力纖維原纖維） IIF 循環(huán)抗基底膜抗體陰性?？蛊交〖?nèi)膜IgA循環(huán)抗體陽(yáng)性（80%）。,,5、 線狀I(lǐng)gA大皰性皮?。↙ABD） DIF IgA在基底膜呈線狀沉積，陽(yáng)性率1

19、00%，1/3病人可有IgM、C3沉積。 IIF 約7—33%病人血清中有循環(huán)抗體IgA，抗原為97KD（沉積在致密板的兩側(cè)，即透明層和致密板下區(qū)）,,6、  妊娠皰疹（HG） 為在妊娠期出現(xiàn)的特殊類型的大皰性類天皰瘡。 DIF 基底膜C3線狀沉積，陽(yáng)性率100%，約30—50%病人也可伴有基底膜IgG線狀沉積。（沉積在透明層） IIF 未查到循環(huán)抗體。

20、,,7、獲得性大皰性表皮松懈癥（EBA） DIF 基底膜IgG、C3沉積,陽(yáng)性率100%,少數(shù)伴IgA、IgM沉積(沉積在透明層) IIF 循環(huán)抗基底膜IgG抗體陽(yáng)性率25—60%。(沉積在基底板下),,,幾種大皰性皮膚病的鑒別診斷,1、BP與EBA鑒別：（1） 臨床特征（2）免疫電鏡和免疫印跡 （3）鹽分離皮膚法：①鹽分離正常皮膚作底物，IIF，EBA抗體與真皮側(cè)起反應(yīng)，BP抗體與表皮側(cè)

21、起反應(yīng)。 ② 鹽分離損害周圍皮膚，DIF,,2、BP與HG鑒別： BP，70%IIF可查到IgG抗基底膜循環(huán)抗體，而大多數(shù)HG病人查不到循環(huán)抗體，HG病人血清含補(bǔ)體結(jié)合的循環(huán)抗BMZ抗體（又稱HG因子），用IIF很難檢出。,,3、線狀I(lǐng)gA大皰性皮膚病與DH鑒別： 線狀I(lǐng)gA大皰性皮膚病，DIF檢查基底膜處IgA線狀沉積，循環(huán)抗體為IgA，而DH是真皮乳頭顆粒狀I(lǐng)gA沉積。,大皰性皮膚病抗體沉積部位

22、超微結(jié)構(gòu)圖,圖1、正常表皮基底膜超微結(jié)構(gòu),圖2、表皮基底膜顯示自身抗體結(jié)合部位的超微結(jié)構(gòu),,,圖3、 大皰性皮膚病自身抗體沉積部位及抗原分子量,圖4、尋常型天皰瘡(DIF),,圖5、尋常型天皰瘡(IIF),,圖6、IgA天皰瘡(DIF),,圖7、大皰性類天皰瘡(DIF) IgG沉積,,圖8、大皰性類天皰瘡(DIF) C3沉積,,圖9、線狀I(lǐng)gA大皰性皮膚病(DIF) IgA沉積,,圖10、獲得

23、性大皰性表皮松懈癥鹽分離正常皮膚(IIF) IgG沉積在真皮側(cè),,圖11、大皰性類天皰瘡鹽分離正常皮膚(IIF) IgG沉積在表皮側(cè),,圖12、紅斑狼瘡(DIF) IgM帶狀沉積,,少見(jiàn)大皰性皮膚病例介紹,例1患者 女 43歲，干部 口腔潰瘍，疼痛3個(gè)月。 口腔雙側(cè)頰粘膜后側(cè)及舌左側(cè)緣表淺潰瘍，左側(cè)頰粘膜潰瘍約0.5×0.3cm，未見(jiàn)水皰。,圖13,,圖14,,圖15,,例2,患者

24、 男 21歲 農(nóng)民主訴：全身反復(fù)起水皰3年，復(fù)發(fā)加重1個(gè)月現(xiàn)病史：3年前雙足起水皰，易破潰，3天后泛發(fā)全身，用激素治療后消退，但停藥后復(fù)發(fā)，反復(fù)治療達(dá)2年余，至5個(gè)月前停藥，又復(fù)發(fā)，收入院治療。皮膚科檢查：四肢軀干廣泛密集分布豆大丘疹，水皰，皰壁緊張，尼氏征（-），頭皮散在淡紅色斑塊，軀干散在大小不一淡白色斑片，口腔粘膜（-）。病理檢查：表皮下水皰，皰底真皮淺層散在嗜酸性粒細(xì)胞。膠原纖維水腫，血管擴(kuò)張。 DI

25、F 表皮基底膜IgG、C3強(qiáng)陽(yáng)性沉積，IgM、IgA弱陽(yáng)性。,圖16,,圖17,,圖18,,圖19,,圖20,,圖21,,圖22,,參 考 文 獻(xiàn),1、Inter J Dermatol 1993;32(3):153-1612、Dermatologic cinic 1994;12(1):133-1423、Dermatologic cinic 1993;11(3):399-4184、J of Cutan Pathol 19