2015藥典無菌檢查常州培訓

1、1,2015藥典-無菌檢查,江蘇省醫(yī)療器械檢驗所,2024年3月,1,2,主要內(nèi)容,無菌產(chǎn)品理念無菌和無菌檢查法概念 無菌操作及無菌技術(shù)要求無菌檢查法的局限性醫(yī)療器具無菌檢驗依據(jù)實驗環(huán)境條件及人員要求試驗主要設(shè)備培養(yǎng)基種類用途及配制要求培養(yǎng)基適用性檢查方法適用性試驗供試品的無菌檢查,2024年3月,2,1、無菌產(chǎn)品理念,滅菌產(chǎn)品的無菌保證不能依賴最終產(chǎn)品的無菌檢驗，它是作為確定批無菌產(chǎn)品是否無菌的一個檢驗項目，而產(chǎn)品

2、的無菌保證要取決于生產(chǎn)過程中采用合格的滅菌工藝、良好的無菌保證體系和嚴格的GMP管理。,2024年3月,3,3,4,無菌 ：是指某一物體或某一環(huán)境中不含有活的微生物。無菌檢查法 ：用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。,2 、無菌和無菌檢查法概念,2024年3月,4,3、無菌操作及無菌技術(shù)要求,無菌操作 是指在無菌環(huán)境條件下，在對無菌制品或無菌器械等進行檢驗的過程中，能防止微

3、生物污染與干擾的一種常規(guī)操作方法。無菌技術(shù) 是指在微生物試驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其他干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施，無菌試驗器材及無菌操作。,2024年3月,5,5,4、無菌檢查法的局限性,若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試 品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。,2024年3月,6,6,7,5、 醫(yī)療器具無菌檢驗依據(jù),本規(guī)范選用于《中國藥典》2015年版 四部 1101無菌檢查法。GB/T 142

4、33.2-2005 《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 ，第二部分：生物試驗方法中規(guī)定的無菌試驗方法。,2024年3月,7,8,6、實驗環(huán)境條件要求,2015藥典無菌檢查：應在無菌條件下進行，試驗環(huán)境必須達到無菌檢查的要求，檢驗全過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染，防止微生物污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度

5、驗證。隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進行驗證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。,2024年3月,,8,6.1實驗環(huán)境潔凈度要求（修改）,2024年3月,9,,9,10,6.2 實驗環(huán)境人員要求：,菌檢人員必須具備微生物專業(yè)知識，并 經(jīng)過無菌技術(shù)培訓。,2024年3月,10,11,7 、試驗主要設(shè)備,細菌培養(yǎng)箱霉菌培養(yǎng)箱超凈工作臺可調(diào)溫的培養(yǎng)箱顯微鏡臺式高壓蒸汽滅菌器立式高壓蒸汽滅菌器電熱恒溫干燥箱集菌儀,2024年

6、3月,11,12,試驗儀器（1） - 超凈工作臺,2024年3月,12,13,試驗設(shè)備（2）--隔水式恒溫培養(yǎng)箱,2024年3月,13,14,試驗設(shè)備（3）----霉菌培養(yǎng)箱,2024年3月,14,15,試驗設(shè)備（4）-立式高壓蒸汽滅菌器,2024年3月,15,16,試驗設(shè)備（5）--臺式蒸汽滅菌器,2024年3月,,16,17,試驗設(shè)備（6）-- 顯 微 鏡,2024年3月,,17,18,試驗設(shè)備（7）-生物安全柜,2024年3月

7、,,18,19,試驗設(shè)備（8）Equinox 全自動無菌檢驗系統(tǒng),2024年3月,19,20,8、 培養(yǎng)基種類及用途,硫乙醇酸鹽流體基（主要用于厭氣菌培養(yǎng)、也可用于需氧菌培養(yǎng)）胰酪大豆胨液體基（用于真菌和需氧菌培養(yǎng)）,,2024年3月,,20,21,8.1 培養(yǎng)基配制及要求,培養(yǎng)基的滅菌 ：配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。保存時間：制備好的培養(yǎng)基應保存在：2 ～25℃、避光環(huán)境。 非密閉容器中：一般在三周內(nèi)使用； 密

8、閉容器中：一般可在一年內(nèi)使用。,2024年3月,21,22,8.2 培養(yǎng)基配制及要求,硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：配制后調(diào)節(jié)PH值為弱堿性，使滅菌后在25 ℃的pH為7.1±0.2，分裝在適宜的容器中，其裝量與容器高度的比列應符合培養(yǎng)后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基的氧化層（粉紅色）的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1／5，否則，須經(jīng)100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一

9、次，并防止被污染。硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：置30～35℃培養(yǎng)。,2024年3月,22,23,8.3 培養(yǎng)基配制及要求,胰酪大豆胨液體基：取培養(yǎng)基成分混合，微溫溶解，濾過，調(diào)節(jié)PH值約為7.3±0.2，加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。胰酪大豆胨液體基：置20～25℃培養(yǎng)。,2024年3月,23,24,8.4 培養(yǎng)基配制及要求,培養(yǎng)基裝量：對于采用直接接種法檢查的供試品，應根據(jù)供試品接種量確定培養(yǎng)基的裝量，每個容器中培養(yǎng)基的用量

10、應符合接種的供試品體積不大于培養(yǎng)基體積的10%。供試品檢查時，培養(yǎng)基的用量和高度同方法適用性試驗。,2024年3月,24,25,9、培養(yǎng)基適用性檢查,無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基等應符合培養(yǎng)基的無菌檢查及靈敏度檢查的要求。無菌性檢查：每批培養(yǎng)基隨機取不少于5支（瓶），置培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，應無菌生長。靈敏度檢查：用于培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代不得超過5代（從菌種保存中心獲得的干燥菌種為0代）

11、，采用適宜的方法保存；并以保證試驗菌株的生物學特性。,2024年3月,25,26,9.1 培養(yǎng)基適用性檢查,菌種：試驗用菌株及菌液制備：金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003銅綠色假單胞菌[CMCC(B)10104] 枯草桿菌[CMCC(B)63501] 生孢梭菌[CMCC(B)64941] 白色念珠菌[CMCC(F)98001] 黑曲霉[CMCC(F)98003],2024年3月,26,27,2024年3月,注：10倍梯

12、度稀釋；選擇適宜的3個稀釋級別；要求＜100cfu/ml。,27,28,9.2 培養(yǎng)基適用性檢查,菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18 ～24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上， 20～25℃培養(yǎng)24 ～48h，上述培養(yǎng)物用pH7.0無菌氯化鈉

13、-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌量小于100cfu菌懸液；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上， 20～25℃培養(yǎng)5 ～ 7天，加入3～ 5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管中，用含0.05%（V/V）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)小于100cfu孢子懸液；（如表9.3）注：菌懸液在室溫

14、下2h使用,若保存在2 ～8 ℃可在24小時內(nèi)使用。,2024年3月,28,29,9.3 培養(yǎng)基靈敏度檢查,2024年3月,培養(yǎng)基靈敏度檢查使用6株菌見下表,29,30,9.4 培養(yǎng)基適用性檢查,培養(yǎng)基接種 　　　　　　　　　　　　 金黃色葡萄球菌2支 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 銅綠假單胞菌2支　 12ml（7支）

15、 生孢梭菌2支 空白對照1支 分別接種小于100cfu金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、生孢梭菌菌懸液各2支,另1支不接種作為空白對照,培養(yǎng)3天，逐日觀察結(jié)果。,,2024年3月,30,31,9.5培養(yǎng)基適用性檢查,培養(yǎng)基接種　　　 枯草芽孢桿菌 2支

16、 胰酪大豆胨液體基 白色念株菌 2支 9ml（7支） 黑曲霉 2支　　 　 　　 空白對照1支 每分別接種小于100cfu枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑

17、曲霉各2支,另1支不接種作為空白對照,培養(yǎng)5天，逐日觀察結(jié)果。,,2024年3月,31,32,9.6 培養(yǎng)基適用性檢查,結(jié)果判斷 空白對照管應無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管試驗菌生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。,2024年3月,32,33,10. 方法適用性試驗,試驗目的:1)進行無菌檢查時，應進行方法適應性試驗，以確認所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查；2)若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時，應重新

18、進行方法適用性試驗；3)方法適用性試驗按“供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進行操作。對每一試驗菌應逐一進行方法確認。,2024年3月,33,34,10.1 方法適用性試驗,菌種及菌液制備 ：除大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 4 4102〕外，金黃色葡萄球菌 、 枯草芽孢桿菌  、 生孢梭菌、 白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。

19、注：大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。,2024年3月,34,10.2 方法適用性試驗,35,2024年3月,36,10.3 方法適用性試驗,結(jié)果判斷 與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查法和檢驗條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用?？刹捎茫?)

20、增加沖洗量，或增加培養(yǎng)基的用量；2)使用中和劑，或更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法適用性試驗。注：方法適用性試驗也可與供試品的無菌檢查同時進行。,36,2024年3月,11、供試品的無菌檢查,無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。供試品無菌檢查所采用的檢查和檢驗條件應與方法適用性試驗確認的方法相同。無菌試驗過程中，若需試驗表面活性劑、中和劑，應證明其有效性，且對微生物無毒性。,37,37,2024年3

21、月,11.1 供試品無菌檢查,38,2024年3月,11.2 供試品的無菌檢查,陽性對照應根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌：,39,2024年3月,11.3 供試品的無菌檢查,陰性對照 ：供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照；陰性對照不得有菌生長。,2024年3月,40,40,41,11.4 供試品的無菌檢查,薄膜過濾法：薄膜過濾法應采用封閉式薄膜過濾器。無菌檢查用的濾膜孔徑應不大于0.45μm，直

22、徑約為50 mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。 水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分干燥，為發(fā)揮濾膜最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試品經(jīng)薄膜過濾后，若需要沖洗液沖洗濾膜。每張濾膜每次沖洗量為100ml.,且總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。,2024年3月,41,11.5 供試

23、品的無菌檢查,水溶性供試品：取規(guī)定量，直接過濾，或混合至含不少 于100ml適宜稀釋的無菌容器中，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用，須用沖洗液沖洗濾膜。沖洗次數(shù)不少于三次，所用的沖洗量、沖洗方法同方法適用性試驗。除生物制品外，一般樣品沖洗后，1份濾器加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，1份濾器加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。,例如：,42,2024年3月,11.6供試品的無菌檢查,水溶性固體供試品：取規(guī)定量，加適宜的稀釋液溶解

24、或按標簽說明復溶，然后按水溶液供試品項下的方法進行操作。具有導管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）供試品：取規(guī)定量，每個小包裝用50-100ml沖洗液分別沖洗內(nèi)壁，收集沖洗液于無菌容器中，然后照水溶液供試品項下方法操作。同時應采用直接接種法進行包裝中所配帶的針頭的無菌檢查。,43,2024年3月,11.7 供試品的無菌檢查,具有導管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）供試品：取規(guī)定量，每個小包裝用50-100ml沖洗液分別沖洗內(nèi)壁，收集沖洗液于無

25、菌容器中，然后照水溶液供試品項下方法操作。同時應采用直接接種法進行包裝中所配帶的針頭的無菌檢查。,44,2024年3月,45,11.8 供試品無菌檢查,直接接種法： 適用于無法用薄膜過濾法進行無菌檢查的供試品，即取規(guī)定量供試品分別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。除生物制品外，一般樣品無菌檢查時兩種培養(yǎng)基接種的支/瓶數(shù)相等；生物制品無菌檢查時硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基接種的支/瓶數(shù)為2：

26、1。除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用量應符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。供試品檢查時，培養(yǎng)基的用量和高度同方法適用性試驗。,2024年3月,45,11.9 供試品的無菌檢查,例 如：,46,2024年3月,11.10 供試品的無菌檢查,培養(yǎng)及觀察：將接種的供試品后培養(yǎng)基容器分別按各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天；接種生物制

27、品供試品的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的容器應分成兩等份，一份置30～35 ℃， 一份置20～25 ℃培養(yǎng)。 培養(yǎng)期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。若加入供試品后或培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種同種新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天，觀察接種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判定是否有菌。,47,2024年3月,48,10.11 供試品的無菌檢查,結(jié)果判斷：陽性對照管

28、應生長良好，陰性對照管不得有菌生長，否則試驗無效。若供試品管均澄清，或顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若供試品中任何一管顯渾濁并確證有菌生長判供試品符合規(guī)定，除非能充分證明試驗結(jié)果無效，即生長的微生物非供試品所含?！　?符合下列任何一個條件，可判試驗結(jié)果無效： （1）無菌檢查試驗所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求。 （2）回顧無菌試驗過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污

29、染的因素。 （3）供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當引起的。,2024年3月,48,49,11.12 供試品的無菌檢查,結(jié)果判斷：試驗若經(jīng)確認無效，應重試。 重試時，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定； 若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。,2024年3月,49,表1 批出廠產(chǎn)品及生物制品的原液和半成品最少檢驗數(shù)量,2024年3月,50,注