微生物代謝調(diào)節(jié)和代謝工程新

1、微生物的代謝調(diào)節(jié)和代謝工程,微生物的生長(zhǎng)過(guò)程中機(jī)體內(nèi)的復(fù)雜代謝過(guò)程是相互協(xié)調(diào)和高度有序的，并對(duì)外環(huán)境的改變能迅速作出適應(yīng)反應(yīng)。 我們的目的：讓微生物建立新的代謝方式，高濃度的積累人們所期望的產(chǎn)品。,代謝調(diào)節(jié)代謝工程,代謝調(diào)節(jié),,1、微生物的代謝類型和自我調(diào)節(jié)2、酶活性調(diào)節(jié)3、酶合成調(diào)節(jié)4、分支生物合成途徑調(diào)節(jié)5、能荷調(diào)節(jié)6、代謝調(diào)控（人為）7、次級(jí)代謝與次級(jí)代謝調(diào)節(jié),微生物的自我調(diào)節(jié),微生物體內(nèi)物質(zhì)的合成和降解是由其

2、自我調(diào)控的。 在單一有機(jī)化合物碳源的培養(yǎng)基中，大分子合成途徑中各個(gè)環(huán)節(jié)配合的很好，效率高。 存在多種不同的碳源時(shí)，細(xì)胞會(huì)優(yōu)先吸收某一碳源，在體內(nèi)合成大量與代謝相關(guān)的酶類。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,分解途徑,合成代謝,,葡萄糖合成,,,培養(yǎng)基中葡萄糖,培養(yǎng)基中甘露糖,,,抑制？阻遏？,自我調(diào)節(jié)的部位,膜系統(tǒng)的選擇性吸收。核內(nèi)相關(guān)基因的調(diào)控表達(dá)。酶系在細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)被分隔。,酶活性的調(diào)節(jié),調(diào)節(jié)的是已有酶

3、的活性，是在酶化學(xué)水平上發(fā)生的調(diào)節(jié)。包括酶活性的激活和抑制兩個(gè)方面。,酶合成的調(diào)節(jié),調(diào)節(jié)的是酶分子的合成量，是在遺傳水平上發(fā)生的調(diào)節(jié)包括酶合成的誘導(dǎo)和阻遏,二種水平上的重要的兩種方式：反饋抑制和反饋?zhàn)瓒?酶活性調(diào)節(jié),酶的激活作用酶的抑制作用,酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制——?jiǎng)e構(gòu)調(diào)節(jié)（變構(gòu)調(diào)節(jié)）,別構(gòu)效應(yīng) ：底物或底物以外的物質(zhì)和別構(gòu)酶分子上的相應(yīng)部位可逆地非共價(jià)結(jié)合后，通過(guò)酶分子構(gòu)象的變化影響酶的催化活性，這種效應(yīng)稱為別構(gòu)效應(yīng) 別構(gòu)效應(yīng)劑

4、：引起別構(gòu)效應(yīng)的物質(zhì)稱為效應(yīng)物 別構(gòu)激活劑：凡是和酶分子結(jié)合后使酶反應(yīng)速度加快的別構(gòu)效應(yīng)劑就稱為別構(gòu)激活劑（正效應(yīng)劑） 別構(gòu)抑制劑：（負(fù)效應(yīng)劑）,別構(gòu)酶：具有別構(gòu)效應(yīng)的酶稱之為別構(gòu)酶 別構(gòu)酶通常能對(duì)反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用，是調(diào)節(jié)酶的一種。,別構(gòu)酶舉例——大腸桿菌（E. coli）天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（簡(jiǎn)稱ATCase）,,ATCase有二個(gè)底物和CTP、ATP二個(gè)別構(gòu)效應(yīng)劑——Asp、ATP是別構(gòu)激活劑，CTP是別構(gòu)抑制劑,ATCase（

5、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶）,ATCase的相對(duì)分子質(zhì)量是310 000，由12條多肽鏈組成每個(gè)調(diào)節(jié)亞基上有兩個(gè)別構(gòu)效應(yīng)劑（CTP、ATP）的結(jié)合部位,完整有活性的酶,催化亞基（三聚體）,調(diào)節(jié)亞基（二聚體）,酶合成的調(diào)節(jié),誘導(dǎo)和阻遏 誘導(dǎo)：某種化合物作用下，導(dǎo)致某種酶合成或合成速率提高的現(xiàn)象。 阻遏：某種化合物作用下，導(dǎo)致某種酶合成停止或合成速率降低的現(xiàn)象。,酶合成的誘導(dǎo)作用,組成酶：不依賴于酶底物或底物的結(jié)構(gòu)類似物的存在二合

6、成的酶。 誘導(dǎo)酶：依賴于某種底物或底物的結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成的酶。,酶合成的阻遏,酶合成的阻遏：在微生物代謝中，胞內(nèi)某種產(chǎn)物的積累造成該產(chǎn)物合成途徑中前面某種酶的合成受到阻礙。末端產(chǎn)物阻遏：如果代謝產(chǎn)物是合成途徑的終產(chǎn)物，則為末端產(chǎn)物阻遏。分解代謝產(chǎn)物阻遏：如果代謝產(chǎn)物是某種化合物分解的中間產(chǎn)物，則為分解代謝產(chǎn)物阻遏。葡萄糖效應(yīng),酶合成的機(jī)制,乳糖操縱子模型誘導(dǎo)和阻遏,分支生物合成途徑的調(diào)節(jié),同工酶調(diào)節(jié)協(xié)同反饋抑制

7、增效（合作）反饋抑制 累積反饋抑制順序反饋抑制聯(lián)合激活或抑制調(diào)節(jié)酶的共價(jià)修飾,,AK：天冬氨酸激酶； HSDH：天冬氨酸脫氫酶,分支生物合成途徑的調(diào)節(jié),同工酶：E. coli 天冬氨酸族氨基酸合成，天冬氨酸激酶I、II、III。協(xié)同反饋調(diào)節(jié)：一種酶受到反饋調(diào)節(jié)，但需要一種以上終產(chǎn)物過(guò)量累加反饋調(diào)節(jié)：多個(gè)末端產(chǎn)物抑制第一個(gè)酶，單獨(dú)只能部分抑制或阻遏，總的效果是累加的增效反饋調(diào)節(jié)：多個(gè)末端產(chǎn)物抑制第一個(gè)酶，多個(gè)末端產(chǎn)物抑制第

8、一個(gè)酶，單獨(dú)只能部分抑制或阻遏，總的效果是增效的,分支生物合成途徑的調(diào)節(jié),順序反饋調(diào)節(jié)：依次反饋調(diào)節(jié)聯(lián)合激活或抑制調(diào)節(jié)：一種生物合成的中間產(chǎn)物參與兩個(gè)完全獨(dú)立的、不交叉的合成途徑的控制。這種中間體物質(zhì)濃度的變化會(huì)影響這兩個(gè)獨(dú)立代謝途徑的代謝效率。 如：腸細(xì)菌氨甲酰磷酸合成酶的聯(lián)合激活和抑制調(diào)節(jié),分支生物合成途徑的調(diào)節(jié),酶的共價(jià)修飾 大腸桿菌谷胺酰胺合成酶 由于共價(jià)修飾引起活力的改變 有無(wú)腺苷?；?中間產(chǎn)物,U,V,W,末端產(chǎn)物

9、,,,,,t,u,v,w,,,,反饋抑制,末端產(chǎn)物直線式抑制,,,,,,,,,,,,,,,,,,,A,B,C,D,E,F,G,H,a,b,c,,,,,,,同工酶調(diào)節(jié),能荷代謝,能荷：細(xì)胞中ATP、ADP、AMP系統(tǒng)中可為代謝反應(yīng)功能的高能磷酸鍵的量度。 表示式：P64（35） 大腸桿菌的能荷在生長(zhǎng)期間為0.8，靜止期為0.5。,代謝調(diào)控,在人為條件的控制下，可以使微生物過(guò)量產(chǎn)生各級(jí)初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物。一般可以根

10、據(jù)代謝調(diào)節(jié)理論，通過(guò)改變發(fā)酵工藝條件如pH、溫度、通氣量、培養(yǎng)基的組成和微生物遺傳特性等，達(dá)到改變菌體內(nèi)的代 謝平衡，過(guò)量產(chǎn)生所需要產(chǎn)物的目的。,代謝調(diào)控發(fā)酵條件的控制改變細(xì)胞的透性菌種遺傳特性的改變,在生產(chǎn)中，如果發(fā)酵的條件不同，可能生成的主要產(chǎn)物也不同?？刂撇煌陌l(fā)酵條件，影響微生物的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，使其體內(nèi)代謝按人們?cè)O(shè)想的方向進(jìn)行。,,(一）發(fā)酵條件的控制,1. 以谷氨酸生產(chǎn)工藝為例 —各種發(fā)酵條件

11、改變的影響,工業(yè)化生產(chǎn)開始于由水解小麥面筋或大豆蛋白質(zhì)而制取。 1957年，日本率先采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，并投入大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，這是被譽(yù)為現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的重大創(chuàng)舉，使發(fā)酵工業(yè)進(jìn)入調(diào)節(jié)代謝的調(diào)控階段。,產(chǎn)生菌株特點(diǎn)：革蘭氏陽(yáng)性不形成芽胞沒(méi)有鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)需要生物素作為生長(zhǎng)因子在通氣條件下才能產(chǎn)生谷氨酸。,谷氨酸生物合成機(jī)理： 由三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生的α-酮戊二酸，在谷氨酸脫氫酶和氫供體存在下進(jìn)行還原性氨化作用而得到。,P

12、roduction Process of L-Glutamic acid,Sketch of main reaction in Corynebacterium glutamicumConnected with the citric acid cycly,不通發(fā)酵條件對(duì)谷氨酸產(chǎn)生菌代謝方向的影響,,,,發(fā)酵條件 代謝方向,通氣

13、 乳酸或琥珀酸 谷氨酸NH4+ a-酮戊二酸 谷氨酸 谷氨酰胺生物素 乳酸或琥珀酸 谷氨酸,,,,,,,,,適量,適量,適量,不足,不足,不足,不足,適量,2．添加生物合成的前體,合成途徑中增加其中一個(gè)前體的量，可以大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)量。,前體：某些化合物在加入培養(yǎng)基后，能夠直接在生物合成過(guò)程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而自身

14、的結(jié)構(gòu)并未發(fā)生太大變化，這類小分子物質(zhì)稱為前體。,PEP,色氨酸合成途徑,鄰氨基苯甲酸,色氨酸,鄰氨基苯甲酸,反饋抑制,3-脫氧-2-酮-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-P,4-P-赤蘚糖,,,,,,,,,,,,3、其他條件的控制使用誘導(dǎo)物---- 生產(chǎn)相關(guān)酶類時(shí)，可以加入相應(yīng)的底物作為誘導(dǎo)物，可以有效增加這些酶的產(chǎn)量。培養(yǎng)基成分和濃度的控制----- 盡量避免由于培養(yǎng)基的不當(dāng)使用引起的分解代謝阻遏。在發(fā)酵培養(yǎng)基中通常采用適量的速效和遲

15、效碳源、氮源的配比。,（二）改變細(xì)胞透性,發(fā)酵過(guò)程中，可以控制使用那些影響細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)作為培養(yǎng)基的成分，有利于代謝產(chǎn)物分泌出來(lái)，從而避免了末端產(chǎn)物的反饋抑制調(diào)節(jié)。,1. 通過(guò)生理學(xué)手段控制細(xì)胞膜滲透性,2. 通過(guò)細(xì)胞膜缺損突變控制細(xì)胞膜滲透性,,（三）菌種遺傳特性的改變,改變微生物的遺傳特性，即改變酶的活性或酶的合成系統(tǒng)，使之對(duì)反饋調(diào)節(jié)不敏感，達(dá)到過(guò)量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的目的。 用于這樣生產(chǎn)的菌株多為抗反饋調(diào)節(jié)突變株和營(yíng)養(yǎng)

16、缺陷型菌株。,,應(yīng)用抗反饋調(diào)節(jié)突變株解除反饋調(diào)節(jié),抗反饋調(diào)節(jié)突變株：對(duì)反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐曰蚣娑兄木辍?反饋抑制或阻遏或兩者解除。,,,,,,,,,,,,,,,分解途徑,合成代謝,,蘇氨酸合成,,,培養(yǎng)基中蘇氨酸類似物,抑制或阻遏解除,,利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株生產(chǎn)的氨基酸,,,,產(chǎn)物 菌株 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 基質(zhì) 效價(jià)（g/L）,L-瓜氨酸 枯草桿菌

17、 精氨酸 葡萄糖 16L-賴氨酸 谷氨酸棒狀桿菌 蘇氨酸，蛋氨酸 葡萄糖 50L-尿氨酸 谷氨酸棒狀桿菌 精氨酸 葡萄糖 25L-苯丙氨酸 石蠟棒狀桿菌 酪氨酸 正烷烴 15L-蘇氨酸

18、 大腸桿菌 Lys, Met, ILe 葡萄糖 20,工業(yè)上利用抗反饋調(diào)節(jié)突變株生產(chǎn)的氨基酸,,,,產(chǎn)物 菌株 所抗結(jié)構(gòu)類似物,L-精氨酸 谷氨酸棒狀桿菌 D-精氨酸L-組氨酸 谷氨酸棒狀桿菌 三唑丙氨酸L-異亮氨酸 短桿菌 α-氨

19、基-β-羥基戊酸L-蘇氨酸 短桿菌 α-氨基-β-羥基戊酸,,次級(jí)代謝與次級(jí)代謝調(diào)節(jié),初級(jí)代謝和次級(jí)代謝次級(jí)代謝的調(diào)節(jié)類型,,（一）初級(jí)代謝和次級(jí)代謝初級(jí)代謝：普遍存在于生物中的代謝類型，微生物從外界吸收各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過(guò)分解代謝和合成代謝，生成維持生命活動(dòng)所必需的物質(zhì)和能量的過(guò)程，稱為初級(jí)代謝。。初級(jí)代謝產(chǎn)物：?jiǎn)翁恰⒑塑账?、脂肪酸等單體，以及由他們組成的各種大分子聚合物如蛋白質(zhì)、核酸等，

20、是有機(jī)體生存必不可少的物質(zhì)。,次級(jí)代謝：某些微生物為了避免代謝過(guò)程中，某種代謝產(chǎn)物的積累造成的不利作用，而產(chǎn)生的一類有利于生存的代謝類型。次級(jí)代謝產(chǎn)物：在次級(jí)代謝途徑中合成的產(chǎn)物，不是微生物生長(zhǎng)所必需的，種類很多，如氨基糖衍生物等。,次級(jí)代謝不同于初級(jí)代謝。初級(jí)代謝自始至終貫穿于細(xì)胞的生活周期中，對(duì)外界環(huán)境變化敏感性小，其合成酶專一性強(qiáng)。 而次級(jí)代謝僅在細(xì)胞體生長(zhǎng)的某個(gè)階段產(chǎn)生，對(duì)外界環(huán)境變化敏感，合成酶專一性不強(qiáng)。,現(xiàn)代抗

21、生素的定義: 由某些微生物產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì),能抑制微生物和其他細(xì)胞增殖的物質(zhì)叫做抗生素。,（二）次級(jí)代謝的調(diào)節(jié)類型總體類型包括： 酶的合成誘導(dǎo)和阻遏 酶活性的激活和抑制細(xì)分類型包括：氮分解產(chǎn)物調(diào)節(jié)、碳分解 產(chǎn)物調(diào)節(jié)和磷酸鹽調(diào)節(jié)等等。,,反饋調(diào)節(jié)1、次級(jí)代謝產(chǎn)物的自身反饋調(diào)節(jié)，包括反饋抑制和反饋?zhàn)瓒簟?/p>

22、,2、分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié) 碳的分解產(chǎn)物和氮的分解產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)作用存在于次級(jí)代謝中。 如葡萄糖抑制發(fā)酵中青霉素、春日霉素、吲哚霉素、放線菌素等抗生素的合成。 鏈霉素產(chǎn)生菌培養(yǎng)中，銨鹽作唯一氮源時(shí)，可對(duì)鏈霉素合成產(chǎn)生抑制作用。,3、初級(jí)代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié) 3.1 初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成之間有一條共同的合成途徑，當(dāng)初級(jí)代謝產(chǎn)物積累時(shí)，反饋抑制了某一步反應(yīng)的進(jìn)行，而最終抑制了次級(jí)代謝產(chǎn)物的合

23、成。,α - 酮戊二酸,青霉素合成途徑調(diào)節(jié),高檸檬酸合成酶,δ-腺苷酸-α-氨基己二酸,α - o氨基己二酸,反饋抑制,高檸檬酸,乙酰CoA,,,,,,,,,,,青霉素G,δ-（α-氨基己二酸酰） -L-半胱氨酸,賴氨酸,,,,,,,反饋?zhàn)瓒?3.2初級(jí)代謝產(chǎn)物直接參與次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成，當(dāng)初級(jí)代謝產(chǎn)物積累，反饋抑制自身的合成，同時(shí)也影響了次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。,4．磷酸鹽的調(diào)節(jié),磷酸鹽不僅是菌體生長(zhǎng)的主要限制性營(yíng)養(yǎng)成分，還

24、是調(diào)節(jié)抗生素生物合成的重要參數(shù)。其機(jī)制按效應(yīng)劑說(shuō)有直接作用，即磷酸鹽自身影響抗生素合成，可能通過(guò)抑制相關(guān)酶的活性。間接作用，即磷酸鹽調(diào)節(jié)胞內(nèi)其他效應(yīng)劑(如ATP、腺苷酸能量負(fù)荷和cAMP)，進(jìn)而影響抗生素合成。已發(fā)現(xiàn)過(guò)量磷酸鹽對(duì)四環(huán)素、氨基糖苷類和多烯大環(huán)內(nèi)酯等32種抗生素的合成產(chǎn)生阻抑作用。,利用基因工程技術(shù)，定向改造細(xì)胞代謝途徑，并與基因調(diào)控、代謝調(diào)控相結(jié)合，構(gòu)建新的代謝途徑 包括三種代謝工程設(shè)計(jì)方法： 改變代謝

25、途徑 擴(kuò)展代謝途徑 構(gòu)建新的代謝途徑,代謝工程概述,A,C,B,D,F,,,,,加速,代謝旁路,,,,,,,缺失,,,,,E,擴(kuò)展途徑,G,新途徑,,H,三種方法的簡(jiǎn)易圖示,（一）改變代謝途徑 改變分支代謝途徑的流向，阻斷其他代謝途徑的合成，提高目的產(chǎn)物。,1. 加速限速反應(yīng)（以頭孢霉素C為例）青霉素N是頭胞霉素合成的中間體用頂頭孢發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn)青霉素N的積累下一步酶反應(yīng)是頭胞霉素合成的限速步驟乙酰氧基

26、頭胞霉素C合成酶克隆了這個(gè)酶的基因（cefEF），并轉(zhuǎn)化到頂頭孢中轉(zhuǎn)化子頭胞霉素C產(chǎn)量提高了,A,C,B,,,,加速,,2. 改變分支代謝流向 提高代謝分支點(diǎn)的某一代謝途徑酶系的活性，在與另外的分支代謝途徑的競(jìng)爭(zhēng)中占優(yōu)勢(shì) 在lys合成中，選育出解除了反饋抑制和缺失高絲氨酸脫氫酶的突變株，提高了lys產(chǎn)量,A,B,D,,,,,,,,,缺失,,,3. 構(gòu)建代謝旁路 大腸桿菌糖代謝的

27、末端產(chǎn)物乙酸達(dá)到一定濃度時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用 將枯草桿菌乙酰乳酸合成酶基因克隆到大腸桿菌，使大腸桿菌中乙酸濃度保持在不引起細(xì)胞中毒的濃度以下,A,C,B,F,,,代謝旁路,,,（二）擴(kuò)展代謝途徑在引入外源基因后，使原來(lái)的代謝途徑向后延伸，產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物使原來(lái)的代謝途徑向前延伸，可以利用新的原料合成代謝產(chǎn)物,A,B,D,,,,E,E,,釀酒酵母不能直接利用淀粉產(chǎn)生乙醇將淀粉酶基因克隆轉(zhuǎn)化后，表達(dá)效率很低用巴斯

28、德畢氏酵母抗乙醇阻遏的醇氧化酶基因啟動(dòng)子表達(dá)淀粉酶基因，效率較高,（三）轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑克隆少數(shù)基因，使原來(lái)無(wú)關(guān)連的兩條代謝途徑聯(lián)系起來(lái)，形成新的途徑，合成新的產(chǎn)物將催化某一代謝途徑的基因組克隆到另一微生物中，使之發(fā)生代謝轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生目的產(chǎn)物,1. 轉(zhuǎn)移代謝途徑 真氧產(chǎn)堿菌（Alcaligenes eutrophus）可產(chǎn)生聚羥基丁酸（PHB）和聚羥基烷酸（PHA） 將A. eutrophus P

29、HB多聚酶、硫解酶和還原酶基因在內(nèi)的 PHB 操縱子一起克隆到大腸桿菌中,A,B,D,,,,G,新途徑,,H,2. 構(gòu)建新的代謝途徑 將質(zhì)粒定向插入Saccharopolyspora eryfhraea的編碼紅霉素合成途徑中第一個(gè)酶 reyF 基因中 使該菌合成一種新的抗生素 6-脫氧合霉素A 在胃中低 pH 中比合霉素穩(wěn)定,作業(yè)：如何區(qū)分酶合成調(diào)節(jié)和酶活性調(diào)節(jié)。,,中間體：是指養(yǎng)分或基質(zhì)進(jìn)入一途徑后被轉(zhuǎn)化為一種或多種不同