實驗三藥物敏感試驗和消毒滅菌

1、實驗三 消毒滅菌和藥敏試驗,實驗內(nèi)容和要求,1.掌握藥敏試驗的原理、步驟、結(jié)果及 意義2.掌握常用的消毒與滅菌技術(shù)3.熟悉紫外線殺菌試驗的原理4.了解細菌L型的誘導(dǎo)和菌落類型,3,一、藥敏試驗在感染性疾病防治中的意義,近年來，由于各種抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致耐藥菌株的迅速增多。尤其是廣譜及超廣譜抗生素的普遍使用，造成耐藥菌株大量出現(xiàn)，給臨床治療帶來極大的困難。同時，由于不合理的使用抗生素，治療的失敗率及不良反應(yīng)均有增加。因

2、此，藥敏試驗在感染性疾病的防治方面具有日益重要的實際意義。,4,二.培養(yǎng)+藥敏的目的,1、 確定導(dǎo)致感染的病原菌的種類，對于不同的病原菌（G-桿菌或G+球菌，條件致病菌或急性傳染病病原菌）需要采取不同的治療措施。 2 、 確定病原菌對各種抗生素的敏感性，指導(dǎo)臨床根據(jù)病人情況合理用藥。由于細菌耐藥性的快速增長，單純依賴經(jīng)驗選用藥物經(jīng)常無效，在更多的時候需要參考藥敏實驗的結(jié)果。 3、用于流行病學(xué)調(diào)查及院內(nèi)感染的監(jiān)控，減少耐藥菌株的流行。

3、,5,三、什么情況下需要做培養(yǎng)+藥敏？,感染原因無法確定。病原菌的耐藥性無法確定，經(jīng)驗用藥可能失?。ㄓ绕涫敲庖吡Φ拖禄颊?、長期使用抗生素者、ICU病房、院內(nèi)感染患者、接受導(dǎo)管插入或其他創(chuàng)傷性治療患者。）病人對可用藥物過敏，需要檢測其他藥物的耐藥性。病人個體情況要求對某些藥物精確用藥，需要測定其最低抑菌濃度（MIC）。,四、常用抗菌藥物敏感性試驗與耐藥檢測方法介紹,其原理： 體外測定抗生素藥物抑菌或殺菌的能力?？蓭椭R床對感染性疾病

4、選擇最佳用藥，還可進行流行病學(xué)調(diào)查，了解某些致病菌耐藥性變異情況。紙片擴散法（Kirby-Bauer test） 稀釋法（dilution test） E試驗法（E test） 聯(lián)合藥物敏感試驗 特殊耐藥菌及耐藥酶的表型檢測耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的檢測β-內(nèi)酰胺酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶檢測等,五、紙片擴散法（K-B法）,原理：含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不

5、斷向紙片周圍區(qū)域擴散，形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的細菌生長被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑制濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）呈負相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小。,方法：菌液制備：挑取孵育16-24h的血平板上數(shù)個菌落置于生理鹽水管中，校正濃度至0.5麥氏標準；涂布接種：無菌棉拭蘸取菌液，在試管壁旋轉(zhuǎn)擠去多

6、余菌液后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60º，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周；貼含藥紙片：平板在室溫下干燥3-5min，用無菌鑷子將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心相距應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm；孵育：35ºC 16-18h，量取抑菌圈直徑。,,注意事項,1 紙片應(yīng)分布均勻，中心距離不小于24mm。2 含菌平板必須避免過濃或過稀。3 紙片貼完后應(yīng)在15min內(nèi)將平板反過來

7、，置于37度溫箱中。4 紙片一旦接觸培養(yǎng)基就不應(yīng)再挪動位置。5 要注意無菌操作。,影響藥敏結(jié)果的因素,培養(yǎng)基應(yīng)根據(jù)試驗菌的營養(yǎng)需要進行配制。傾注平板時，厚度合適（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養(yǎng)皿，傾注培養(yǎng)基18-20ml為宜。培養(yǎng)基內(nèi)應(yīng)盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質(zhì)，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。細菌接種量細菌接種量應(yīng)恒定，如太多

8、，抑菌圈變小，能產(chǎn)酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。藥物濃度藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結(jié)果，需精確配制。商品藥應(yīng)嚴格按照其推薦治療量配制。培養(yǎng)時間一般培養(yǎng)溫度和時間為37℃ ，8-18小時，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養(yǎng)基，先置4℃冰箱內(nèi)2~4小時，使抗菌藥預(yù)擴散，然后再放37℃溫箱中培養(yǎng)，可以推遲細菌的生長，而得到較大的抑菌圈。,結(jié)果判讀：用刻度尺量取抑菌圈直徑，根據(jù)CLSI（Clinical

9、and Laboratory Standards Institute）標準判讀結(jié)果；報告：細菌對該抗生素是 敏感（susceptible，S）； 耐藥（resistant，R）； 還是中介（intermediate，I）。,12,六、如何理解MIC值及藥敏結(jié)果？,每種藥物均提供定性和定量兩種結(jié)果。 定性：敏感（S）表示該藥物對該細菌有抑制或殺滅作用。使用常規(guī)劑 量可以達到有效的治療效果。

10、 中介（中度敏感，I）表示細菌對該藥物治療的敏感性低于敏感 菌株，必須加大劑量以達到更高的血藥濃度才能在特定的生理部 位獲得有效的臨床效力；對于使用劑量有嚴格限制的藥物則必須 重復(fù)測試以確定敏感還是耐藥。 耐藥（R）表示藥物常規(guī)劑量所達到的藥物濃度不能抑制或殺死 細菌，即使加大劑量也不能達到治療效果或者

11、超過了人體的正常 耐受水平。 定量：MIC（最低抑菌濃度）表示在體外達到抑制細菌生長所需要的最 低的藥物濃度。臨床治療要求的血藥濃度一般為MIC值（μg/ml） 的4-8倍。對于不同部位的不同藥物，其濃度可能更高或更低。 應(yīng)具體情況具體分析，不可一概而論。,13,長期使用抗生素的病人應(yīng)該怎樣做藥敏試驗？,長期使用抗生素的病人尤其是住

12、院病人應(yīng)該經(jīng)常做藥敏試驗。所謂的長期，并不是一個很長的時間概念，住院病人每隔3-4天就需要做一次細菌學(xué)檢查。對于ICU病房的病人，可能每天都要做細菌學(xué)檢查。因為這些病人多數(shù)免疫力較差，容易受條件致病菌的侵犯，而且反復(fù)發(fā)作。此外病原菌常呈多重耐藥性，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的G-桿菌（ESBL）以及耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA和MRSCN）、產(chǎn)AmpC酶的陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌在ICU病房最為常見。對于長期使用抗生素的病人，其感染有以下幾個

13、特點； 1.長期使用抗生素的病人，不同時期（即使在很短的時間內(nèi)）感染的病原菌種類可能不同，耐藥性因此也不相同。 2、同一株細菌，在長時間用藥時，僅需要3-4天就可以從對某種藥物敏感發(fā)展為耐藥。 3.長期使用抗生素容易誘發(fā)細菌產(chǎn)生L型變異。常規(guī)培養(yǎng)陰性時，進行L型細菌培養(yǎng)能夠提高檢出率。,形成條件：,生物學(xué)特性：,與醫(yī)學(xué)關(guān)系：,細胞壁中肽聚糖結(jié)構(gòu)受理化或生物因素的直接破壞或合成抑制而形成。,形態(tài)多形性 ；染色革蘭陰性；培

14、養(yǎng)高滲培養(yǎng)基；菌落油煎蛋樣,仍有一定致病性,細菌L型－細胞壁缺陷細菌,臨床分離葡萄球菌L型,葡萄球菌L型回復(fù)后,15,滅菌－殺滅或除去所有微生物的繁殖體和芽胞。消毒－殺滅或除去病原微生物。防腐－抑制微生物的生長與繁殖。抑菌劑或防腐劑。除菌:用沖洗、過濾等機械手段除去微生物的方法化療：用對病原菌有毒力但對機體無害的化學(xué)物質(zhì)殺滅或抑制機體內(nèi)病原微生物的方法,消毒與滅菌技術(shù)基本概念,擦拭法,高壓蒸汽滅菌法,常用消毒滅菌的方法,物理法

15、,化學(xué)法,浸泡法,熏蒸法,噴霧法,,,,,,熱力消毒法,生物凈化法,輻射消毒法,燃燒法,烤箱法,煮沸法,干熱法,濕熱法,日光曝曬法,紫外線燈照射法,電子滅菌燈法,電離輻射法,,,,,,,,,,煮沸消毒法,操作規(guī)程將物品刷洗干凈，全部浸沒在水中，或在水中加入碳酸氫鈉配成1％一2％的濃度，可將沸點提高到105℃．還可去污防銹。加熱煮沸。水沸后開始計時5—10 min，如中途加入物品，則在第二次水沸后重新計時。關(guān)閉熱源，用無菌持物鉗

16、取出消毒物品。,,焚燒----最徹底的滅菌方法,燒灼----直接用火焰滅菌方法 如接種環(huán)、試管口、三角瓶口,干烤----加熱160-170℃ 2h 玻璃器皿、陶瓷,1、干熱滅菌法,,紅外線----熱效應(yīng)，與干烤類似,滅菌效果：可殺死營養(yǎng)體和芽胞,,2.濕熱滅菌法,,高壓蒸汽滅菌法（熱壓滅菌法）,最有效的濕熱滅菌法 121 ℃ 15-20mim（殺芽胞),煮沸消毒法,水煮100 ℃ 5mim(殺繁殖體)-2

17、h(殺芽胞),流通蒸汽消毒法,巴氏消毒法,間歇蒸汽滅菌法,水蒸汽100 ℃ 15-30mim(殺繁殖體),反復(fù)多次流動蒸汽間歇加熱滅菌(殺芽胞）,,,,,較低的溫度 61 ℃ 30mim/71 ℃ 30s（殺致病菌）,,壓力蒸汽滅菌的效果監(jiān)測,物理監(jiān)測法　　用150℃或200℃的留點溫度計。使用前將溫度計汞柱甩至50℃以下，放入包裹內(nèi)，滅菌后檢查其讀數(shù)是否達到滅菌溫度　化學(xué)監(jiān)測法　主要是通過化學(xué)指示劑的化學(xué)反應(yīng)，滅菌后呈現(xiàn)的顏色變化來

18、辨別是否達到滅菌的要求。臨床常用的化學(xué)指示卡與化學(xué)指示膠帶，化學(xué)指示卡放在包的中央，化學(xué)指示膠帶粘貼在包的外面。,生物監(jiān)測法　是最可靠的監(jiān)測法，利用對熱耐受力較強的非致病性嗜熱脂肪桿菌芽孢作為指示劑，制成每片含106個嗜熱脂肪桿菌芽孢的菌紙片,使用時將10片菌紙片分別放于滅菌器四角及中央，待滅菌完畢，用無菌鑷取出后．再放人培養(yǎng)基內(nèi)，在56℃溫箱中培養(yǎng)48h至1周，若全部菌紙片無細菌生長則表示滅菌合格。,消毒與滅菌技術(shù) 輻射滅菌法 ?

19、非電離輻射：紫外線,最佳殺菌波長為250～270nm殺菌機理：干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄 特點：紫外線穿透力較弱適應(yīng)范圍：紫外線消毒適用于空氣消毒與物品表面的消毒。,消毒與滅菌技術(shù)濾過除菌法,殺菌機理：含有微細小孔<0.22μm,只允許液體或氣體及孔徑<0.22μm的顆粒通過，細菌不能濾過。不能除病毒、支原體適用范圍：血清、毒素、輸液、生物制品、抗生素以及空氣等的除菌。,促進菌體蛋白質(zhì)變性凝固（酚、醇、醛、酸堿類等

20、）干擾細菌酶系統(tǒng)和代謝（氧化劑、重金屬鹽類等）損傷細菌細胞膜，增加其通透性（表面活性劑、脂溶劑等）菌體成分氧化、水解或結(jié)構(gòu)改變（氧化劑、鹵素、醛、酚等）,消毒與滅菌技術(shù) 化學(xué)消毒劑作用機制,,,,,,化學(xué)消毒劑的使用方法,浸泡法 侵泡法是將物品洗凈、擦干后，浸沒在消毒液中進行消毒滅菌的方法。擦拭法 擦拭法是用消毒劑直接擦拭人體或物品表面，如皮膚、桌椅等，達到消毒滅菌的方法。噴霧法 噴霧法是利用噴霧器將消毒劑變成微粒氣

21、霧彌散在空氣中．對空氣和物品表面進行消毒滅菌的方法。熏蒸法 熏蒸法是將消毒劑加熱或加人氧化劑，使其產(chǎn)生氣體來進行消毒滅菌的方法。,化學(xué)消毒劑的使用方法,問題與討論,1.常見的消毒滅菌技術(shù)有哪些？分別有什么用途？滅菌的標準是什么？2.紫外線殺菌作用的原理如何？有什么特點？3.什么是細菌L型？細菌L型的形態(tài)染色有什么特點？分離培養(yǎng)細菌L型的培養(yǎng)基有什么特點？,本次實驗課結(jié)束明天看試驗結(jié)果，值日同學(xué)留下實驗四 化膿性球菌