研究國(guó)人大腸癌病人somaticapc基因變異與大腸癌用藥預(yù)后存活之

1、1,APC、MGMT 分子變異與國(guó)人大腸癌發(fā)生及預(yù)後之關(guān)係 演 講 者：陳 錫 秉,2,研究背景簡(jiǎn)介,3,國(guó)人大腸癌發(fā)生率逐年攀升趨勢(shì)(Colorectal cancer, CRC) 大腸癌：84 年國(guó)人發(fā)生率第 5 名的癌癥85 年起升為第 4 名91 年起再攀升為第 3 名92 年起成為女性癌癥的第 2 名93 年起成為男性癌癥的第 2 名 新發(fā)

2、生個(gè)案數(shù)從民國(guó) 84 年的 4217 人 增加到 94 年的 9604 人， (中華民國(guó)癌癥登記報(bào)告),4,大腸癌在所有癌癥中排名 發(fā)生率排名 死亡率排名 男 女 男 女

3、國(guó)人 2 2 3 3 美國(guó) 3 3 3 3 (中華民國(guó) 94 年癌癥登記報(bào)告, Siegel R et al. CA Cancer J Clin 2008),,,,,5,國(guó)人大腸癌發(fā)生率成長(zhǎng)曲線

4、 (中華民國(guó)行政院衛(wèi)生署公佈資料),6,國(guó)人94年大腸結(jié)直腸癌發(fā)生與死亡資料 新發(fā)生 粗發(fā)生率 新死亡 粗死亡率 個(gè)案數(shù) (每10萬(wàn)人) 個(gè)案數(shù) (每10萬(wàn)人)全民 9604

5、 42.18 4111 18.05男性 5497 47.54 2425 20.97 女性 4107 36.64 1686 15.04

6、 (中華民國(guó) 94 年癌癥登記報(bào)告),,,7,,散發(fā)性 (sporadic)：約90%年老、男性、體重過重、高油低纖飲食、煙、酒、膽囊切除術(shù)、膽管腸道造廔術(shù)、女性動(dòng)情激素、有腸道息肉病史 、有結(jié)腸直腸癌病史、家族中有人罹大腸癌(不符合遺傳定律),危險(xiǎn)因子,(Weitz J et al. Lancet 2005),8,,遺傳性 (hereditary)：約10%FAP: 1~2%HNPCC: 5~10%其它:

7、 ~1%,Familial adenomatous polyposis (FAP) 家族性腺瘤息肉癥Hereditary nonpolyposis colorectalcancers (HNPCC) 遺傳非息肉性大腸癌,(Weitz J et al. Lancet 2005),9,,FAPAPC基因突變HNPCCMMR基因突變,Adenomatous polyposis coli (APC) gene大腸腺瘤息肉基因

8、Mismatch repair (MMR) genes修復(fù)DNA配對(duì)錯(cuò)誤的基因,危險(xiǎn)因子,(Weitz J et al. Lancet 2005),10,,,約60~80%具有APC 突變,FAPAPC突變表現(xiàn)度(penetrance)幾乎達(dá)100%,,HNPCCMMR突變表現(xiàn)度約70~85%,(Fearnhead NS et al. Hum Mol Genet 2001),,遺傳性,,,散發(fā)性,,後天產(chǎn)生的突變som

9、atic mutation,與生俱來(lái)的突變germline mutation,11,APC 在大腸癌發(fā)展過程所處地位,正常上皮,,早期腺瘤,,中期腺瘤,,晚期腺瘤,,癌,Kras,Smad1, Smad2,APC,p53,約15年,,,,12,APC 基因簡(jiǎn)介位置：染色體 5q21-5q22基因長(zhǎng)度：91067 個(gè)鹼基對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物：2843 個(gè)胺基酸, 312 kD,(NCBI OMIM *611731 APC GENE),

10、13,國(guó)外 germline APC 突變情形,(Fearnhead NS et al. Hum Mol Genet 2001),14,國(guó)外 somatic APC 突變情形,(Fearnhead NS et al. Hum Mol Genet 2001),15,研究目標(biāo)一、研究國(guó)人 germline APC 基因變異與罹患大腸癌之關(guān)係。二、研究國(guó)人大腸癌病人 somatic APC 基因變異與大腸癌用藥、預(yù)後存活之關(guān)係。,

11、16,一、研究國(guó)人 germline APC 基因變異與罹患大腸癌之關(guān)係。,17,研究設(shè)計(jì)疾病組跟對(duì)照組做比較研究，研究 APC 基因上的變異點(diǎn)在兩組人中分布差異。,18,研究對(duì)象收案條件疾病組：經(jīng)慈濟(jì)及三軍總醫(yī)院大腸直腸科醫(yī)師確定 診斷為大腸癌患者。對(duì)照組：經(jīng)大腸鏡檢查無(wú)發(fā)現(xiàn)大腸腫瘤者。 本研究最後共收受健康受檢者 74 人，大腸癌病人 80 人，從周邊靜脈抽取其全血做為研究檢體。並無(wú)特別排除者。,1

12、9,研究對(duì)象基本特質(zhì),,,,,,http://www.colorectal-surgery.net/knowledge/describe1.asp,20,研究方法1.從檢體抽取出DNA 2.進(jìn)行 PCR (polymerase chain reaction) 放大 APC 全基因 exons 3.進(jìn)行 dHPLC (denaturing high performance liquid chromatograp

13、hy) 篩檢4.以 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer 進(jìn)行定序5.定序資料使用PC作業(yè)系統(tǒng) BioEdit v7.0.5 (Tom Hall, 2005) 軟體比對(duì)6.統(tǒng)計(jì)資料分析,21,ABI 3100定序結(jié)果範(fàn)例,22,Bioedit 比對(duì)情形範(fàn)例,23,結(jié)　　果,24,所有發(fā)現(xiàn)的APC變異,,,,,fs: frameshift,轉(zhuǎn)譯框架移位,25,26,與國(guó)外 germline

14、APC 變異比較圖,(Fearnhead NS et al. Hum Mol Genet 2001),,,,,,,27,兩組分佈有差異的APC變異,28,基因變異　 OR (95%CI) p c.1458T>C C (vs. T) 1.78 (0.99~3.19) 0.054 c.4479G>A A (vs.

15、G) 2.89 (1.37~6.07) 0.005 c.5268T>G G (vs. T) 2.70 (1.44~5.06) 0.002 c.5465A>T T (vs. A) 0.18 (0.04~0.81) 0.026,,,基因變異對(duì)罹大腸癌之危險(xiǎn)對(duì)比值 (OR),29,變異點(diǎn)　基因型 OR (95%CI)

16、 p c.1458T>C CC 2.77 (1.38~5.56) 0.004 (vs. CT+CC) c.4479G>A AA 3.20 (1.44~7.11) 0.004 (vs. AG+GG) c.5268T>G GG 2.53 (1.24~5.13) 0.010

17、 (vs. GT+GG) c.5465A>T AT 0.16 (0.03~0.78) 0.023 (vs. AA),,,不同基因型對(duì)罹大腸癌之危險(xiǎn)對(duì)比值 (OR),30,在健康人與病人組之間分佈有顯著差異的變異點(diǎn)有c.1458T>C、c.4479G>A、c.5268T>G、c.5465A>T四點(diǎn) c.1458T>C、c.4

18、479G>A、c.5268T>G 較高罹癌危險(xiǎn)c.5465A>T 較低罹癌危險(xiǎn),結(jié) 果 摘 要,31,Germline APC 基因的突變率在國(guó)人大腸癌患者中極低，有可能是因?yàn)闆]鎖定是 FAP的患者，也可能是國(guó)人發(fā)生大腸癌的重要觸發(fā)基因是別的基因。從國(guó)人 germline APC 基因的突變率低與在這麼少的突變之中就發(fā)現(xiàn)5處國(guó)外未報(bào)告過的變異，可合理推論測(cè)人罹大腸癌的基因相關(guān)性：有國(guó)人特有的種族特異性。找出

19、國(guó)人大腸癌特異基因值得進(jìn)一步的研究。,討 論,32,二、研究國(guó)人大腸癌病人 somatic APC 基因變異與大腸癌用藥、預(yù)後存活之關(guān)係。,33,研究設(shè)計(jì)取 CRC 病人大腸腫瘤組織，研究 APC 基因體突變 (somatic mutation) 對(duì)病人預(yù)後存活的關(guān)係，並取病人大腸正常組織做為 APC 基因變異之控制。,34,研究對(duì)象收案條件經(jīng)慈濟(jì)與三軍總醫(yī)院大腸直腸科醫(yī)師確定診斷為大腸癌患者，並經(jīng)外科切除手術(shù)可取得

20、大腸組織(正常與癌組織)者。本研究共收受117位病人，紀(jì)錄其診出大腸癌年紀(jì)、性別、腫瘤位置、腫瘤分化程度、癌癥分期、化療及放療情形。,35,招募時(shí)間從 2001 年 1 月 1 日至 2004 年 12 月 31 日，追蹤觀察時(shí)間從受檢者接受外科切除手術(shù)開始，追蹤觀察至其死亡或 2006 年 7 月 31 日截止。　　研究對(duì)象之存活時(shí)間以 Kaplan-Meier 法處理與分析。失去聯(lián)絡(luò)者或至觀察截止日期 2006 年 7 月

21、31 日仍存活者視為 censored observations，以 censored data 處理。,36,研究對(duì)象基本特質(zhì),37,研究對(duì)象基本特質(zhì),38,結(jié)　　果,39,所有發(fā)現(xiàn)的APC變異,,fs:閱讀框架移位 X:轉(zhuǎn)譯終止,,,,4,2,2,40,所有發(fā)現(xiàn)的APC變異,,2,41,與國(guó)外 somatic APC 變異比較圖,(Fearnhead NS et al. Hum Mol Genet 2001),MCR: mutat

22、ion cluster region,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,42,APC突變與病人存活關(guān)係 (Kaplan-Meier, 全死因),時(shí)間 (月數(shù)),有突變 △ 非死亡截止點(diǎn),無(wú)突變 ○ 非死亡截止點(diǎn),,,0 10 20 30 40 50 60 70,100 90

23、 80 70 60 50,存活率 (%),log rank testP = 0.612,43,0 10 20 30 40 50 60 70,100 90 80 70 60,時(shí)間 (月數(shù)),存活率 (%),APC突變與病人存活關(guān)係 (Kaplan-Meier, 大腸癌死因),log r

24、ank testP = 0.502,有突變 △ 非死亡截止點(diǎn),,,無(wú)突變 ○ 非死亡截止點(diǎn),44,Cox's proportional-hazards model各因子致死的危險(xiǎn)度使用 Cox's proportional-hazards model 分析。Hazard： 存活者中下一瞬間死亡人數(shù) 上一瞬間存活人數(shù)即存活者下一瞬間死亡機(jī)率(

25、死亡趨勢(shì)),,45,APC突變：有突變 = 1, 無(wú)突變= 0 H(t) / H0(t) = exp(β1*APC突變) ◎ exp(β1* 1) = exp(β1) = Hazard Ratio ☆ exp(β1* 0) = exp(0) = 1exp(β1) = 2：任何時(shí)候有APC突變者的死亡趨勢(shì)　　　　　　　　　 是無(wú)APC突變者的2倍,迴歸模式可如下表示

26、：H(t) = H0(t) * exp(β1*基因突變 + β2*性別 + …)H(t) / H0(t) = exp(β1*基因突變 + β2*性別 + …)= Hazard Ratio,46,單因子 Cox's proportional-hazards model 分析,47,多因子 Cox's proportional-hazards model 分析,48,APC突變與5-FU化療交互作用,49,以APC

27、有無(wú)突變分層分析,50,117位病人中在29人中發(fā)現(xiàn)29處嚴(yán)重 (造成閱讀框架移位或轉(zhuǎn)譯終止) 突變 這些突變對(duì)病人預(yù)後存活無(wú)直接顯著相關(guān)這些突變與5-FU化療對(duì)於病人預(yù)後存活有交互作用5-FU化療只降低無(wú)這些突變的病人的死亡趨勢(shì),結(jié) 果 摘 要,51,討 論,52,Somatic APC 突變與 5-FU 化療的交互作用，這是首次發(fā)現(xiàn)並且會(huì)直接影響到病人臨床治療效果的重大發(fā)現(xiàn)。此研究是小樣本的探索性研究，尚未控

28、制很多重要的影響因子，但這個(gè)顯異的結(jié)果值得進(jìn)一步招募更多參與者來(lái)做研究。 參考此次初步研究結(jié)果，在往後的研究中，在招募參與者時(shí)，可先控制癌癥分期、腫瘤位置、大腸癌類型等變項(xiàng)，若參與者夠多，可再控制年紀(jì)與性別變項(xiàng)。,53,此研究所發(fā)現(xiàn)的 APC 突變與 5-FU 化療的交互作用，其分子機(jī)制還不清楚，若能在眾多臨床研究上都確認(rèn)此結(jié)果， 則可做實(shí)驗(yàn)室研究找出其分子機(jī)制。若能在眾多臨床研究上都確認(rèn)此結(jié)果，應(yīng)推廣到整個(gè)醫(yī)療體系上對(duì)於大腸癌

29、患者的治療方針。我們建議對(duì)於考慮接受5-FU化療的大腸癌患者，宜先做APC基因檢測(cè)，無(wú)突變者再考慮是否進(jìn)行5-FU化療。,54,此次研究除了得到無(wú) APC 基因突變者，接受 5-FU化療才有好效果的結(jié)論外，我們從研究結(jié)果應(yīng)可合理懷疑有 APC 基因突變者，接受 5-FU 化療可能比不受 5-FU 化療結(jié)果更差，但因分層後樣本數(shù)變小，使上述結(jié)果不顯著，在往後研究中宜注意此點(diǎn)。,55,三、研究國(guó)人大腸癌病人 somatic APC

30、與 MGMT 基因 promoter 甲基化與大腸癌用藥、預(yù)後存活之關(guān)係。,56,甲基化 (CH3)我們除了研究在 APC 基因本身的(genetic)變異之外，更考慮做基因外變異(epigenetic)中甲基化的研究。,,,,常發(fā)生在 promoter 區(qū) CpG island 的 C 上ATGCTCGTAGTAGTCGCGTAA CH3 CH3 CH3,,,,57,O-6-Meth

31、ylguanine DNA methyltransferase (MGMT),,,,,MGMT基因,,,其它基因,MGMT蛋白質(zhì),,,甲基化,,去甲基化,58,,MGMT基因,,,其它基因,MGMT蛋白質(zhì),,,甲基化,,甲基化,,,59,APC 與 MGMT甲基化相關(guān)研究報(bào)告 APC 基因甲基化約在 12% 到 39%。MGMT 基因甲基化約在40% 到 50%。具有 K-ras 基因中鹼基 G 變 A 的變異者，MGMT

32、基因甲基化程度高?；蚣谆摻M織蛋白質(zhì)表現(xiàn)度低。,Lin SY et al. Oncol Rep. 2004 Chen J et al. Carcinogenesis. 2005Arnold CN et al. Cancer Biol Ther. 2004Esteller M et al. Cancer Res. 2001 Qi J et al. World J Gastroenterol. 2005Shen L et

33、 al. J Natl Cancer Inst. 2005,60,研究目標(biāo)三、研究國(guó)人大腸癌病人 somatic APC 與 MGMT 基因 promoter 甲基化與大腸癌用藥、預(yù)後存活之關(guān)係。,61,研究方法1.全 DNA 經(jīng)過 bisulfite 處理2.進(jìn)行 MSP (methylation specific PCR ) 放大 APC 與 MGMT 基因 promoter 部份 DNA 片段3.進(jìn)行電

34、泳並以 ethidium bromide 染色並在 UV 光 下呈色判讀,M欄位有亮條：具有甲基化DNAU欄位有亮條：具有無(wú)甲基化DNA,62,結(jié)　　果,63,APC甲基化存活曲線圖 (Kaplan-Meier, 全死因),時(shí)間 (月數(shù)),有甲基化　△ 非死亡截止點(diǎn),無(wú)甲基化　○ 非死亡截止點(diǎn),,,0 　 10 20 30 40 5

35、0 60 70,100 90 80 70 60 50,存活率 (%),log rank testP = 0.018,64,0 10 20 30 40 50 60 70,100 90 80 70 60,時(shí)

36、間 (月數(shù)),存活率 (%),log rank testP = 0.076,,,有甲基化　△ 非死亡截止點(diǎn),無(wú)甲基化　○ 非死亡截止點(diǎn),APC甲基化存活曲線圖 (Kaplan-Meier,大腸癌死因),65,0 10 20 30 40 50 60 70,100 90 80

37、 70 60,時(shí)間 (月數(shù)),存活率 (%),log rank testP = 0.982,,有甲基化　△ 非死亡截止點(diǎn),無(wú)甲基化　○ 非死亡截止點(diǎn),,,MGMT甲基化存活曲線圖 (Kaplan-Meier, 全死因),66,0 10 20 30 40 50 60 70,1

38、00 90 80 70 60,時(shí)間 (月數(shù)),存活率 (%),log rank testP = 0.992,,有甲基化　△ 非死亡截止點(diǎn),無(wú)甲基化　○ 非死亡截止點(diǎn),,,MGMT甲基化存活曲線圖 (Kaplan-Meier,大腸癌死因),67,甲基化 Cox's proportional-hazards model 分析,68,69,APC 甲基化降低病人全死因死亡趨勢(shì)，對(duì)大腸癌死因而言則無(wú)顯著相關(guān)。

39、MGMT 甲基化不管是對(duì)全死因或大腸癌死因，都與病人的死亡趨勢(shì)無(wú)顯著相關(guān)。 5-FU 化學(xué)治療只降低無(wú) MGMT 基因甲基化病人死亡趨勢(shì)。,結(jié) 果 摘 要,70,現(xiàn) APC 基因 promoter 甲基化主要是抑制 APC 蛋白質(zhì)的表現(xiàn)：不影響5-FU 化學(xué)治療的效果。APC 基因無(wú)義或框架移位突變產(chǎn)生嚴(yán)重異常的 APC 蛋白質(zhì)：使 5-FU 化學(xué)治療較無(wú)效果。異常的 APC 蛋白質(zhì)比缺乏 APC 蛋白質(zhì)有更強(qiáng)烈的影響

40、。APC 蛋白質(zhì)產(chǎn)物不表現(xiàn)與造成 APC 蛋白質(zhì)異常這兩種不同性質(zhì)的分子變異宜分別分析。,討 論,71,Germline APC 基因變異中 c.1458T>C、c.4479G>A、c.5268T>G有較高罹癌危險(xiǎn)c.5465A>T有較低罹癌危險(xiǎn)。Somatic APC 基因無(wú)義或框架移位突變與5-FU化療對(duì)於病人預(yù)後存活有交互作用：5-FU化療只降低無(wú)這些突變的病人的死亡傾向。APC 甲基化降

41、低病人全死因死亡趨勢(shì)。 5-FU 化學(xué)治療只降低無(wú) MGMT 基因甲基化病人死亡趨勢(shì)。,總　摘　要,72,樣本不夠大，缺乏對(duì)一些相關(guān)變項(xiàng)的控制，研究結(jié)果之外推性不佳，需進(jìn)一步更大樣本更佳研究設(shè)計(jì)來(lái)驗(yàn)證。未來(lái)可朝多醫(yī)療單位合作的研究，成立系統(tǒng)性聯(lián)合檢體收樣與保存中心，各種相關(guān)因素紀(jì)錄更加詳實(shí)，追蹤觀察時(shí)間可更長(zhǎng)。更多其他癌癥、基因與治療之間的交互作用，都是值得整個(gè)相關(guān)醫(yī)療合作與研究。,研究限制與改進(jìn),73,謝謝聆聽敬請(qǐng)指教

42、,74,中華民國(guó)行政院衛(wèi)生署官方網(wǎng)站 http://www.doh.gov.tw/cht2006/index_populace.aspx中華民國(guó) 94 年癌癥登記報(bào)告 2007年12月發(fā)佈Siegel R, Ward E, Hao Y, Xu J, Murray T, Thun MJ.Cancer statistics, 2008.CA Cancer J Clin. 2008 Mar-Apr;58(2):71

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