氨基酸和多肽

1、蛋 白 質(zhì) 化 學(xué),學(xué)習(xí)要求,了解蛋白質(zhì)生物功能、分類掌握氨基酸的分類、結(jié)構(gòu)、重要化學(xué)反應(yīng)和分離、分析方法，重點(diǎn)弄清楚它的兩性性質(zhì), pI 和 pK之間的關(guān)系掌握蛋白質(zhì)的的結(jié)構(gòu)層次，以及各種結(jié)構(gòu)層次的基本概念和各自的特點(diǎn)了解蛋白質(zhì)的重要理化性質(zhì)了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的相互關(guān)系,,一、概述 蛋白質(zhì)的涵義,生命是蛋白體的存在方式，這種存在方式本質(zhì)上就在于這些蛋白體的化學(xué)組成部分的不斷的自我更新。---恩格斯 1878年,蛋白質(zhì)

2、是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命活動(dòng)的體現(xiàn)者和執(zhí)行者,一、概述 蛋白質(zhì)的功能多樣性,蛋白質(zhì)作為生命現(xiàn)象的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，構(gòu)成一切細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的最重要的組成成分，參與生物體內(nèi)許多方面的重要功能,,生命體化學(xué)反應(yīng)的催化劑 ? 已知3000種以上新陳代謝的調(diào)節(jié) ? 調(diào)節(jié)蛋白，如生長(zhǎng)激素體內(nèi)及細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸 ? 血紅蛋白對(duì)氧的運(yùn)輸，脂蛋白對(duì)脂類的運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)素的貯存 ? 氮素貯存-卵清蛋白、乳酪蛋白，貯鐵-鐵蛋白,生物體的各種運(yùn)動(dòng)

3、 ? 肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、微管蛋白細(xì)胞的結(jié)構(gòu)成分 ? 角蛋白、膠原蛋白信息的識(shí)別與傳導(dǎo) ? 受體蛋白、血型物質(zhì)生物體防御與進(jìn)攻的武器 ? 抗體蛋白、凝血酶原、抗凍蛋白、蛇毒、蜂毒,,一、概述 蛋白質(zhì)的功能多樣性,根據(jù)蛋白質(zhì)的化學(xué)組成 簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解性和組成 分類表根據(jù)蛋白質(zhì)分子形狀 球狀蛋白質(zhì)和纖維狀蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)生物功能

4、 活性蛋白質(zhì)和非活性蛋白質(zhì),一、概述 蛋白質(zhì)的常見(jiàn)分類法,,,,,蛋白質(zhì)的分類? 分子組成,– 簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)(simple protein) ： 完全由氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì) 清蛋白、球蛋白、谷蛋白、組蛋白等 – 結(jié)合蛋白質(zhì)(conjugated protein) ： 蛋白質(zhì)部分+非蛋白質(zhì)部分(輔助因子) 糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、磷蛋白、血紅素蛋白等,,,蛋

5、白質(zhì)的分類? 形狀和大小,纖維狀蛋白（fibrous protein） – 結(jié)構(gòu)蛋白，大部分不溶于水 膠原蛋白、彈性蛋白、角蛋白、絲蛋白球狀蛋白 （globular protein） – 功能蛋白，大部分溶于水 各種酶、血紅蛋白等膜蛋白 – 結(jié)構(gòu)與功能蛋白，存在于膜上 – 蛋白質(zhì)分子表面存在疏水殘基能與 磷脂分子結(jié)合(疏水作用) – 親水氨基酸殘基比胞質(zhì)蛋白少,,活性

6、蛋白質(zhì)（active protein） 包括生命活動(dòng)過(guò)程中一切有活性的蛋白質(zhì)以及它們的前體分子，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)屬于活性蛋白質(zhì)，包括酶、激素蛋白、運(yùn)輸?shù)鞍祝ㄞD(zhuǎn)運(yùn)蛋白）、貯存蛋白、運(yùn)動(dòng)蛋白、保護(hù)或防御蛋白、受體蛋白、控制生長(zhǎng)和分化蛋白、毒蛋白、膜蛋白等非活性蛋白質(zhì)（passive protein） 對(duì)生物體起支持和保護(hù)作用，主要指硬蛋白包括膠原蛋白、角蛋白、絲蛋白、彈性蛋白等,蛋白質(zhì)的分類? 功能,

7、一、概述 蛋白質(zhì)的組成與結(jié)構(gòu),元素組成：碳50% 、氫7% 、氧23% 、氮16% 、硫0~3% 、 其它元素平均含氮量：16% (凱氏定氮) – 蛋白質(zhì)含量 = 蛋白氮?6.25,蛋白質(zhì)的元素組成,二、氨基酸,氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類氨基酸的理化性質(zhì)氨基酸的分離與分析氨基酸的制備和應(yīng)用狀況,(一) 氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類,氨基酸的通式,構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸有20種 均為?-氨基酸(脯氨酸除外) α-氨基

8、酸有兩種構(gòu)型: D構(gòu)型和L構(gòu)型， 是與甘油醛或乳酸相比較而決定的 蛋白質(zhì)中的氨基酸都是L-型 共同點(diǎn)為在同一碳原子上有羧基、氨 基、和氫 不同點(diǎn)是側(cè)鏈R基不同,20種氨基酸的分類,,? 按照側(cè)鏈R基團(tuán) 結(jié)構(gòu),? 按照側(cè)鏈R基團(tuán) 的極性,20種氨基酸的分子結(jié)構(gòu),,? 甘氨酸無(wú)旋光性? 側(cè)鏈?zhǔn)杷? 甲硫氨酸又稱蛋氨酸，是 體內(nèi)代謝中甲基的供體? 簡(jiǎn)寫(xiě)符號(hào)

9、 甘 (Gly, G) 丙 (Ala, A) 纈 (Val, V) 亮 (Leu, L) 甲 (Met, M) 異 (Ile, I),氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類,,? 側(cè)鏈親水? 脯氨酸側(cè)鏈應(yīng)為非 極性? 簡(jiǎn)寫(xiě)符號(hào) 絲 (Ser, S) 蘇 (Thr, T) 半胱 (Cys,

10、 C) 脯 (Pro, P) 天冬酰胺 (Asn, N) 谷氨酰胺 (Gln,Q),氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類,氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類,? 側(cè)鏈親水? 側(cè)鏈堿性基團(tuán)? 精氨酸是動(dòng)物體內(nèi) 尿素形成的中間物? 簡(jiǎn)寫(xiě)符號(hào) 賴 (Lys, K) 精 (Arg, R) 組 (His, H),? 側(cè)鏈親水? 側(cè)鏈酸性基團(tuán)? 簡(jiǎn)寫(xiě)符號(hào) 天冬

11、 (Asp, D) 谷 (Glu, E),氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類,? 苯丙氨酸、色氨酸側(cè)鏈 疏水? 酪氨酸側(cè)鏈親水? 簡(jiǎn)寫(xiě)符號(hào) 苯丙 (Phe, F) 酪 (Tyr, Y) 色 (Trp, W)? UV特征吸收： ?=280 nm,氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類,,根據(jù)氨基酸R基側(cè)鏈的極性可將氨基酸分為,疏水性氨基酸（非極性氨基酸）,親水性氨基酸（極性氨基

12、酸）,氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類,不帶電荷的極性氨基酸,帶正電荷的堿性氨基酸,帶負(fù)電荷的酸性氨基酸,Asp Glu,Lys ArgHis,Ser Thr TyrAsn Gln CysGly,Ala Val IleLeu Pro Met Phe Trp,,根據(jù)生物體的需要可將氨基酸分為,必需氨基酸,半必需氨基酸,非必需氨基酸,其余氨基酸,Arg、 His,Lys、Val、 IleLeu 、Phe 、Met 、Trp、Thr,氨基酸

13、的結(jié)構(gòu)與分類,非編碼氨基酸,? 構(gòu)成蛋白質(zhì)的編碼氨基酸為20種? 編碼氨基酸經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾產(chǎn)生的非編碼氨基酸，例如5-羥賴氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸精氨酸? 除蛋白質(zhì)中的氨基酸外，迄今發(fā)現(xiàn)150余種非蛋白氨基酸，例如鳥(niǎo)氨酸、 瓜氨酸、 ?-氨基丁酸，這些非蛋白質(zhì)氨基酸有些是代謝中間產(chǎn)物，有些是結(jié)構(gòu)成分等，或者是編碼氨基酸的衍生物，例如β-,γ-,δ-, 和D-型氨基酸,非編碼氨基酸,非編碼氨基酸,胱氨酸,(二) 氨基酸的理化性質(zhì),,一般物

14、理性質(zhì),氨基酸的酸堿性質(zhì),氨基酸的化學(xué)反應(yīng),,,,,氨基酸的光吸收性,氨基酸的理化性質(zhì),α氨基酸為無(wú)色晶體，不同氨基酸晶 體形狀不相同,氨基酸熔點(diǎn)一般在200—300?C,氨基酸的溶解度,各種氨基酸有不同的味感(味精-谷氨酸鈉),氨基酸的光學(xué)性質(zhì)：旋光性和紫外吸收,,一般物理性質(zhì),旋光性：,組成蛋白質(zhì)的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子， 所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面向左或向右旋轉(zhuǎn)，向左旋轉(zhuǎn)的稱左旋，用“-”號(hào)表示，向右旋轉(zhuǎn)

15、的稱右旋，用“+”號(hào)表示。,旋光度，比旋光度,消旋,,外消旋,內(nèi)消旋,,氨基酸的旋光性,光吸收：,組成蛋白質(zhì)的氨基酸中，Trp、Tyr和 Phe對(duì)紫外光有一定的吸收，這是因?yàn)樗鼈兎肿又泻斜江h(huán)，是苯環(huán)的共軛雙鍵造成的，這三個(gè)氨基酸的光吸收都在280nm附近,常用于蛋白質(zhì)濃度的定量 紫外吸收性受溶液pH的影響,275nm,280nm,257nm,氨基酸的酸堿性質(zhì),氨基酸在水溶液中或在晶體狀態(tài)時(shí)主要時(shí)以兩性離子的形式存在,氨基酸在水中的

16、兩性離子既能像酸一樣放出質(zhì)子，也能像堿一樣接受質(zhì)子，氨基酸具有酸堿性質(zhì)，是一類兩性電解質(zhì),氨基酸的理化性質(zhì),氨基酸的酸堿性質(zhì),,氨基酸的等電點(diǎn) pI,氨基酸可解離基團(tuán)的pK值,兩個(gè)重要概念：,不同pH時(shí)氨基酸以不同的離子化形式存在：,正離子,兩性離子,負(fù)離子,氨基酸所帶凈電荷為“零”時(shí)，溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)（isoelectric point），以pI表示,實(shí)驗(yàn)證明在等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸主要以兩性離子形式存在，但也有少量的而且數(shù)

17、量相等的正、負(fù)離子形式，還有極少量的中性分子,當(dāng)溶液的 pH=pI 時(shí)，氨基酸主要從兩性離子形式存在,pH<pI 時(shí)，氨基酸主要以正離子形式存在,pH>pI 時(shí)，氨基酸主要以負(fù)離子形式存在,等電點(diǎn)的計(jì)算,中性氨基酸：以Gly為例,[H+]2 = K1K2,pH =（pK1+pK2）/ 2,pI=（pK1+pK2）/ 2,,側(cè)鏈不含解離基團(tuán)的中性氨基酸，其等電點(diǎn)是它的pK1和pK2的算術(shù)平均值,酸性氨基酸，以Asp為例：,,側(cè)

18、鏈含解離基團(tuán)的氨基酸，其等電點(diǎn)是它的兩性離子兩邊的pK值的算術(shù)平均值， 對(duì)于酸性氨基酸：pI=（pK1+pK2）/ 2,堿性氨基酸，以Lys為例：,側(cè)鏈含解離基團(tuán)的氨基酸，其等電點(diǎn)是它的兩性離子兩邊的pK值的算術(shù)平均值， 對(duì)于堿性氨基酸：pI=（pK2+pK3）/ 2,等電點(diǎn)的計(jì)算,中性氨基酸： pI = 1/2 ( pK1 + pK2 )酸性氨基酸： pI = 1/2 ( pK1 + p

19、KR )堿性氨基酸 pI = 1/2 (pKR + pK2 ),氨基酸的酸堿性質(zhì),氨基酸的酸堿性質(zhì),在等電點(diǎn)以上的任何pH值，氨基酸帶 凈負(fù)電荷，在電場(chǎng)中將向正極移動(dòng) 在低于等電點(diǎn)的任何pH值，氨基酸帶 凈正電荷，在電場(chǎng)中將向負(fù)極移動(dòng) 在一定pH范圍內(nèi)，氨基酸溶液的pH值離 等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，氨基酸所攜帶的凈電荷越大,氨基酸的甲醛滴定,氨基酸的酸堿滴定等電點(diǎn)pH過(guò)高(12~13)或過(guò)低(1~2)

20、，沒(méi)有合適的指示劑可選用甲醛可以與氨基酸形成羥甲基衍生物而降低氨基的堿性，相對(duì)增強(qiáng)了 -NH3的酸性電離,氨基酸的酸堿性質(zhì),氨基酸的每一功能基團(tuán)可被酸堿所滴定，可根據(jù)氨基酸的滴定曲線來(lái)推算pK值,Glu,Gly,His,? 主要的反應(yīng)類型 ? 氨基參與的反應(yīng) 成鹽反應(yīng)、與HNO2反應(yīng)、?；?、烴基化、與甲醛反應(yīng) ? 羧基參與的反應(yīng) 成鹽反應(yīng)、成酯反應(yīng)、 成酰氯、脫羧基、

21、 疊氮反應(yīng) ? 氨基和羧基共同參與的反應(yīng) 與茚三酮反應(yīng)、成肽鍵反應(yīng) ? 側(cè)鏈基團(tuán)參與的反應(yīng) 巰基氧化還原反應(yīng)、苯環(huán)黃色反應(yīng)、酚基米倫式反應(yīng)、 Pauly反應(yīng)、 Folin-酚反應(yīng),氨基酸的化學(xué)反應(yīng),?-氨基參與的反應(yīng),(1) 成鹽作用,(2) 與亞硝酸反應(yīng)(伯胺基),Van Slyke(范斯來(lái)克)定氮法測(cè)定氨基氮的基礎(chǔ)，可用于氨基酸定量和蛋白質(zhì)水解程度的

22、測(cè)定，生成的N2只有一半來(lái)自氨基酸 除?-NH2外，Lys的?- NH2 也能發(fā)生此反應(yīng)，但速度較慢；含亞氨酸的脯氨酸則不能與亞硝酸反應(yīng)， ?-NH2反應(yīng)3~4 min即完全,三鹿奶粉與“嬰兒腎結(jié)石”事件,2008年上半年全國(guó)先后出現(xiàn)“嬰兒腎結(jié)石”的病例，經(jīng)檢測(cè)分析其原因是這些嬰兒均食用了被三聚氰胺所污染的三鹿嬰兒奶粉。,中新網(wǎng)9月16日電 據(jù)中央電視臺(tái)新聞聯(lián)播報(bào)道，國(guó)家質(zhì)檢總局近日緊急在全國(guó)開(kāi)展了嬰幼兒奶粉三氯氰胺含量專項(xiàng)檢查。階段

23、性檢查結(jié)果顯示，三鹿、伊利、蒙牛、雅士利、熊貓、圣元、古城、英雄、惠民、可淇、南山、齊寧、金必氏、施恩、金鼎、奧美多、愛(ài)克丁、御寶、磊磊、寶安力、聰爾壯等22家嬰幼兒奶粉生產(chǎn)企業(yè)的69批次產(chǎn)品檢出了含量不同的三聚氰胺。,罪魁禍?zhǔn)? 三聚氰胺,化學(xué)名稱： 1,3,5-Triamine-2,4,6-Triazine (1,3,5-三氨基-2,4,6-三嗪 ) 其它名稱： 蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺、蛋白精 化學(xué)式:

24、C3H6N6 分子量：126.12,主要用途：,三聚氰胺是氨基腈的三聚體，由它制成的樹(shù)脂加熱分解時(shí)會(huì)釋放出大量氮?dú)猓虼丝捎米髯枞紕?。它也是殺蟲(chóng)劑環(huán)丙氨嗪在動(dòng)物和植物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。 三聚氰胺是制造三聚氰胺-甲醛樹(shù)脂(密胺塑料)的原料。該樹(shù)脂有時(shí)也被俗稱為三聚氰胺，常用于制造日用器皿、裝飾貼面板、織物整理劑等。在中國(guó)，日常生活中最常見(jiàn)的應(yīng)用是一類被成為“美耐皿”(又稱密胺碗)的塑料碗碟。這類器皿的物理性質(zhì)非常類似陶瓷，

25、堅(jiān)硬不變形但又不像陶瓷那樣易碎。常常標(biāo)有“不可以在微波爐中使用”的警示，因?yàn)槿矍璋?甲醛樹(shù)脂（即密胺塑料）受熱后有可能散發(fā)毒性。,草菅人命 ?不法商販的伎倆,三聚氰胺的含氮量為66％左右，由于“凱氏定氮法”是通過(guò)測(cè)出含氮量來(lái)估算蛋白質(zhì)含量，因此，三聚氰胺會(huì)使得食品的蛋白質(zhì)檢測(cè)含量偏高，從而使劣質(zhì)食品通過(guò)食品檢驗(yàn)。三聚氰胺作為一種白色結(jié)晶粉末，無(wú)味，摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，就能提高0.4%蛋白質(zhì)。

26、60;   目前，各個(gè)品牌奶粉中蛋白質(zhì)含量為15~20%，其中蛋白質(zhì)含氮量平均為16%。以某合格牛奶蛋白質(zhì)含量為2.8%計(jì)算，含氮量略為0.44%；以某合格奶粉蛋白質(zhì)含量為18%計(jì)算，含氮量略為2.88%——而三聚氰胺含氮量為66.6%，是牛奶的151倍，是奶粉的23倍！,?-氨基參與的反應(yīng),(3) 酰基化反應(yīng),酰氯：,芐氧酰氯（Cbz-Cl）:,對(duì)甲苯磺酰氯(Tos-Cl) :,叔丁氧酰氯(Boc-Cl):

27、,酸酐：,鄰苯二甲酸酐：,在多肽和蛋白質(zhì)人工合成中用作氨基的保護(hù)反應(yīng),Cbz-Cl,Cbz-氨基酸,氨基酸與 芐氧甲酰氯(Cbz)的反應(yīng),氨基酸與 5一二甲氨基萘-1-磺酰氯（dansyl chloride,DNS）的反應(yīng),用途： 用于多肽鏈N端氨基酸的標(biāo)記和微量氨基酸的定量測(cè)定,,?-氨基參與的反應(yīng),(3) 烴基化反應(yīng),（R’＝烴基）,① 與2、4一二硝基氟苯的反應(yīng),2，4一二硝基氟苯,DNFB,DNP-氨基酸（黃色）,該

28、反應(yīng)首先被英國(guó)的Sanger用來(lái)鑒定多肽、蛋白質(zhì)的N末端氨基酸,② 與苯異硫氰酸酯的反應(yīng),,該反應(yīng)首先被Edman用于鑒定多肽、蛋白質(zhì)的N末端氨基酸，是多肽和蛋白質(zhì)末端分析的重要方法,?-氨基參與的反應(yīng),(4) 與甲醛反應(yīng),甲醛滴定法：不僅用于測(cè)定氨基酸含量，也常用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)水解程度,?-羧基參與的反應(yīng),(1) 成鹽和成酯作用,氨基酸的堿金屬鹽能溶于水，重金屬鹽不溶于水,?；被釋?duì)-硝基苯酯,（活化酯）,（式中Y＝?；?用途：成鹽

29、或成酯后，羧基被保護(hù)而氨基被活化，使得氨基容易與?；蛘邿N基反應(yīng)，這是氨基酸的酰基化和烴基化反應(yīng)需要在弱堿性溶液中進(jìn)行的原因,?-羧基參與的反應(yīng),(2) 成酰氯反應(yīng),用途: 使氨基酸的羧基活化，易與另一氨基酸的氨基結(jié)合，在合成肽的工作上常用使氨基酸的羧基活化，易于另一氨基酸的氨基結(jié)合，在合成肽的工作上常用,(3) 脫羧基反應(yīng),谷氨酸 ?-氨基丁酸,?-羧基參與的反應(yīng),(4

30、) 疊氮反應(yīng),用途：使氨基酸的羧基活化，疊氮化合物常用肽的人工合成,?-羧基參與的反應(yīng),?-氨基和?-羧基共同參與的反應(yīng),(1) 與茚三酮反應(yīng),可以對(duì)氨基酸定量測(cè)定 檢測(cè)570nm的光吸收? 兩個(gè)亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)與茚三酮反應(yīng)不生成NH3，而是直接生成亮黃色化合物，最大吸收在400nm,?-氨基和?-羧基共同參與的反應(yīng),(2) 成肽鍵反應(yīng),注意： 產(chǎn)物具有方向性,側(cè)鏈R基參加的反應(yīng),（1）-S-S-和-SH的氧化還

31、原反應(yīng),半胱氨酸的-SH很活潑，很容易在空氣中重新氧化形成二硫鍵，一般可用鹵代化物對(duì)-SH進(jìn)行保護(hù),(2) Folin-酚反應(yīng),側(cè)鏈R基參加的反應(yīng),用途：該反應(yīng)可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定,1．紙層析法,2．薄層層析法,3．離子交換柱層析法,4．高效液相層析法,氨基酸的分離與分析,1. 分配層析法：,CA：一種物質(zhì)在A相（流動(dòng)相）中的濃度,CB：一種物質(zhì)在B相（固定相）中的濃度,氨基酸的分離與分析,（1）紙層析,單向紙層析圖,Rf值,雙向紙層

32、析圖,固定相：纖維素上的水流動(dòng)相：有機(jī)溶劑,第一相展層劑：丁醇-乙酸第二相展層劑：酚-甲酚-水,（2）薄層層析,支持劑：纖維素粉、硅膠、氧化鋁粉等,2．離子交換層析法,原理：分離氨基酸時(shí)，用離子交換樹(shù)脂作為支持物，利用離子交換樹(shù)脂上的活性基團(tuán)與溶液中的離子進(jìn)行交換反應(yīng)，由于各種離子交換能力不同，與樹(shù)脂結(jié)合的牢固程度就不同，在洗脫過(guò)程中，各種離子以不同的速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離的目的。,這種分離主要與各種離子所帶電荷有關(guān)，在電荷相同時(shí)，

33、與極性、非極性有關(guān)。,離子交換樹(shù)脂,化學(xué)本質(zhì)：是一種人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯組成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物。,外觀： 顆粒狀,陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：活性基團(tuán)是酸性的，如磺酸基-SO3H （強(qiáng)酸型），羧基-COOH（弱酸型）,陰離子交換樹(shù)脂：活性基團(tuán)是堿性的，如季胺基- N+(CH3)3OH-,采用改變pH值或者增加鹽濃度的方式進(jìn)行洗脫各種氨基酸,高效液相層析

34、 (high performance liguid chromatography, HPLC),HPLC的特點(diǎn):,（2）反相層析 (reverse phase chromatography),（1）離子交換層析,（3）凝膠過(guò)濾,理論塔板高，分辨率好，可使氨基酸分析的靈敏度達(dá)到10-12mol水平,用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離下列每對(duì)氨基酸，當(dāng)用pH7.0的緩沖液洗脫時(shí)，下述每對(duì)氨基酸中先從柱上洗脫下來(lái)的是那種氨基酸？（1）天冬氨酸和賴氨

35、酸，（2）精氨酸和甲硫氨酸，（3）谷氨酸和纈氨酸， （4）甘氨酸和亮氨酸，,習(xí) 題,Asp凈電荷為負(fù)，Lys靜電荷為正，Lys與樹(shù)脂磺酸基相反離子吸附作用大，故 Asp ? Lys2. Arg凈電荷為正，Met靜電荷接近零，故 Met ? Arg3. Glu凈電荷為負(fù)，Val凈電荷接近零，故 Glu ?Val4. Gly和Leu凈電荷都接近零，但Leu的非極性側(cè)鏈與樹(shù)脂骨架之間的非極性相互作用大，故 Gly ? Leu,答

36、案,,氨基酸的制備,制備氨基酸有4種途徑：,從蛋白質(zhì)水解液中分離提取,應(yīng)用發(fā)酵法生產(chǎn),應(yīng)用酶的催化反應(yīng)生成氨基酸,有機(jī)合成法,適宜于中小規(guī)模的生產(chǎn),可大規(guī)模生產(chǎn),,,,,氨基酸的制備和應(yīng)用狀況,蛋白質(zhì)的水解,酸水解 6M HCl 或 4M H2SO4, 105~110?C回流20h左右可完全水解，其優(yōu)點(diǎn)是不引起消旋化，得到L-氨基酸。缺點(diǎn)是Trp完全破壞，羥基氨基酸(Ser,Thr)部分被分解，Asn和Gln的酰

37、胺基被水解堿水解 5M NaOH共沸10~20h，大多數(shù)氨基酸遭到不同程度破壞，產(chǎn)生消旋化，引起Arg脫氨生成鳥(niǎo)氨酸和尿素，Trp不被破壞酶水解 不產(chǎn)生消旋化，也不破壞氨基酸，水解不徹底，需要多種酶協(xié)同作用，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，常用于部分水解，常用的酶有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等,,,氨基酸的用途,蛋白質(zhì)的基本組成,對(duì)生物體具有其他特殊的生理作用，參與許多代謝作用，不少已用來(lái)治療疾病,用于食品強(qiáng)化

38、劑、調(diào)味劑、著色劑、甜味劑和增味劑,用于飼料添加劑,調(diào)節(jié)皮膚pH值和保護(hù)皮膚的功能,氨基酸的制備和應(yīng)用狀況,三、肽,肽的基本概念 肽命名 生物體內(nèi)重要的活性肽 肽類的應(yīng)用和發(fā)展前景,,肽的基本概念,? 肽是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸通過(guò)肽鍵連接而形成的化合物，氨基酸之間脫水后形成的鍵稱肽鍵（酰胺鍵）,氨基酸之間通過(guò)肽鍵連接形成的鏈稱肽鏈,N端,氨基酸殘基,氨基酸殘基,C端,肽鏈書(shū)寫(xiě)方式：N端→C端，游離α-氨基在左，游離α-羧基在

39、右，氨基酸殘基之間用“-”表示肽鍵,肽鏈有鏈狀、環(huán)狀和分支狀。,多肽鏈,肽鏈中的氨基酸不是原來(lái)完整的分子，多肽鏈中的氨基酸單位稱為氨基酸殘基,肽鍵,鏈狀結(jié)構(gòu),肽鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，和相鄰的兩個(gè)?碳原子位于一個(gè)平面，不能自由旋轉(zhuǎn)，以穩(wěn)定的反式構(gòu)型存在,肽平面,組成肽鍵的4個(gè)原子和2個(gè)相鄰的C?原子形成肽平面C-N具有部分雙鍵的性質(zhì)(40%) C?-N鍵長(zhǎng)0.145nm, C?N 鍵長(zhǎng)0.125nm C-N鍵長(zhǎng)0.

40、133nm,肽平面可以處于順式構(gòu)型或反式構(gòu)型，其中反式構(gòu)型比順式構(gòu)型穩(wěn)定，兩者能量相差8 kJmol-1, X-Pro的肽鍵可以是反式，也可以是順式構(gòu),當(dāng)兩個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵相互連接形成二肽，在一端仍然有游離的氨基和另一端有游離的羧基，每一端連接更多的氨基酸。氨基酸能以肽鍵相互連接形成長(zhǎng)的、不帶支鏈的寡肽(25個(gè)氨基酸殘基以下)和多肽(多于25個(gè)氨基酸殘基)，多肽仍然有游離的α-氨基和α-羧基,肽的結(jié)構(gòu)和命名,二肽 三肽 四肽,二

41、肽→ 25 肽 稱寡肽（oligopeptide）,多肽（Polypeptide）,,,一般認(rèn)為胰島素的分子量(5700)是蛋白質(zhì)分子量的下限,命名：根據(jù)氨基酸組成，由N端→C端命名,多肽化合物的名稱，通常按照肽內(nèi)氨基酸殘基的排列順序，以殘基名稱（如某某氨酰）從N端依次閱讀到C端，并以C端殘基全名結(jié)束肽的名稱,注意：,在開(kāi)鏈肽的N端和C端可以有游離的?氨基和?羧基，而有的開(kāi)鏈肽的N端或C端游離的?氨基或?羧基被別的基團(tuán)結(jié)合(如烷基化、酰

42、化等)或N端殘基自身環(huán)化,1．兩性解離與等電點(diǎn),肽與氨基酸一樣具有酸、堿性質(zhì)，它的解離主要取決于肽鏈的末端氨基、末端羧基和側(cè)鏈R基。,由于肽中N端自由氨基和C端自由羧基之間的距離比氨基酸中的大，因此它們之間的靜電引力較弱。肽中C端-COOH的pK略大于氨基酸中的pK值，pK1↑。N端-NH+3的pK略小于氨基酸中的pK值，pK2↓。R基的pK變化不大。,肽的理化性質(zhì),肽的等電點(diǎn)：肽所帶凈電荷為“零”時(shí)，溶液的pH值,例：已知末端α-CO

43、OH的pK3.6，末端α-NH3+ 的pK8.0，ε-NH+3的 pK10.6 , 計(jì)算Ala-Ala-Lys-Ala的等電點(diǎn)。,pI=(8.0＋10.6) /2 =9.3,思考題：,如何知道一個(gè)已知蛋白的等電點(diǎn) ？,2．肽的化學(xué)性質(zhì),肽的化學(xué)性質(zhì)與氨基酸相似，如兩性解離、等電點(diǎn)等，但肽有與氨基酸不同的特殊反應(yīng),（1）雙縮脲反應(yīng),（2）肽鍵的紫外吸收210～230nm,生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、細(xì)胞分化、大腦活動(dòng)、

44、腫瘤病變、免疫防御、生殖控制、抗衰老、生物鐘規(guī)律及分子進(jìn)化等均涉及到活性肽。生物活性肽是機(jī)體內(nèi)傳遞信息、調(diào)節(jié)代謝和協(xié)調(diào)器官活動(dòng)的重要化學(xué)信使,活性肽 (active peptide),1. 谷胱甘肽(glutathione,GSH),分子中有一個(gè)特殊的γ肽鍵，是由谷氨酸的γ羧基與半胱氨酸的α氨基縮合而成。由于GSH中含有一個(gè)活潑的巰基很容易氧化，二分子GSH脫氫以二硫鍵相連成氧化型的谷胱甘肽（GSSG）,天然存在的某些活性肽(activ

45、e peptide),,,,谷胱甘肽重要的生物功能,維護(hù)蛋白質(zhì)活性中心的巰基參與二硫化合物相互轉(zhuǎn)化作為某些酶的輔酶，在體內(nèi)氧化還原過(guò)程中起重要的作用,2.多肽抗菌素,天然存在的某些活性肽(active peptide),3. 多肽激素,催產(chǎn)素和加壓素均為9肽，第3位和第8位氨基酸不同。催產(chǎn)素使子宮和乳腺平滑肌收縮，具有催產(chǎn)和促使乳腺排乳作用。加壓素促進(jìn)血管平滑肌收縮，升高血壓，減少排尿,天然存在的某些活性肽(active pepti

46、de),4. 神經(jīng)肽,甲硫氨酸腦啡肽Tyr–Gly–Gly–phe- Met,亮氨酸腦啡肽Tyr-Gly-Gly-phe-Leu,功能：具有強(qiáng)烈的鎮(zhèn)痛作用(強(qiáng)于嗎啡)，不上癮,如腦啡肽 (enkephalin),β-內(nèi)啡肽(31肽) 具有較強(qiáng)的嗎啡樣活性與鎮(zhèn)痛作用,天然存在的某些活性肽(active peptide),5．肌肽和鵝肌肽(二肽),肌肽(carnosine): β-Ala-His,鵝肌肽(anserine)：β-A