通關藤致u937 細胞凋亡效應與機制

1、<p>　　通關藤致U937 細胞凋亡效應與機制</p><p>　　摘　要：目的： 研究通關藤對U937細胞凋亡效應與調控及周期改變。方法：應用噻唑藍(MTT)比色法檢測不同濃度通關藤對U937細胞的增殖抑制作用，以Annexin-Ⅴ/PI雙染法檢測細胞凋亡，以RT-PCR法檢測bax、bcl-2、p53的基因表達水平的改變。結果：10、20、40、80μL/ mL通關藤對U937細胞染毒24h后，細

2、胞相對增殖率為93.33%、86.20%、76.42%、56.75%，10、20、40、80μL/ mL 通關藤對U937細胞染毒24h后的凋亡率為5.67%、7.51%、13.49%、21.61%，10、20、40μL/ mL 通關藤對U937細胞染毒24h后bax/bcl-2的比值為1.35、2.58、4.45，p53的相對表達水平為1.57、2.36、3.57。結論： 通關藤能抑制U937細胞生長，誘導細胞發(fā)生凋亡，且具有劑量反應

3、關系，其凋亡的機制可能與Bax/Bcl-2的上升，及p53的mRNA表達的上調有關。</p><p>　　關鍵詞：通關藤；U937細胞；細胞毒性；Bax/Bcl-2；P53 </p><p>　　近年來，傳統(tǒng)中藥通關藤在實體瘤的臨床治療中取得了較好的療效[1-3]。但通關藤注射液在血液腫瘤治療中應用較少。有研究表明，低濃度的通關藤可誘導白血病 NB4 細胞分化, 高濃度可通過 線粒體途徑誘

4、導白血病細胞U937, HL60凋亡[4-5] 。為進一步探討通關藤抗白血病的作用及相關凋亡的可能機制, 本文用體外對U937細胞進行不同濃度的通關藤染毒，觀察對U937細胞的抑制作用，對細胞凋亡、細胞周期的影響并檢測相關基因的表達。</p><p><b>　　1　材料與方法</b></p><p><b>　　1.1　材料</b></p

5、><p>　　1.1.1 細胞株：</p><p>　　U937 細胞購自中科院上海細胞庫。</p><p>　　1.1.2 主要試劑及儀器：</p><p>　　通關藤注射液( 消癌平注射液, 20 mL/ 支, 批號:20070405111)、凱基活細胞/凋亡細胞/壞死細胞鑒別試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；Mithras LB9

6、41多功能酶標儀（德國Berthold technologics），PCR儀(Eppendorf-AG)，凝膠成像處理系統(tǒng)(ChemilmagerTM 5500 Alpha innotech)，ABI 7300型熒光定量PCR儀（美國應用生物系統(tǒng)中國公司）。</p><p><b>　　1.2　方法</b></p><p>　　1.2.1 通關藤對U937細胞的增值

7、抑制作用</p><p>　　以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基正常培養(yǎng)細胞。實驗時取對數(shù)生長期細胞以1×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，用含通關藤終濃度為, 10、20、40、80μL/ mL的培養(yǎng)基100μl染毒24 h，每個劑量設3個平行。染毒結束后吸取培養(yǎng)基，加入含10% MTT的無血清培養(yǎng)基100μl作用4 h，再吸取培養(yǎng)基，加入150 ?l DMSO溶解藍紫色結晶物,每

8、孔平行吸取三次各150 ?l到96孔板在酶標儀上選擇490 nm波長測定各孔吸光度值(A)。按公式計算各組細胞相對增值率, 細胞相對增值率(%) = (各染毒組A值-空白組A值) ×100% /（陰性對照A值-空白組A值)。</p><p>　　1.2.2 通關藤對U937細胞凋亡作用</p><p>　　取對數(shù)生長期細胞以2×105 個/孔接種于六孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24

9、 h。劑量效應研究：用含通關終濃度為0、10、20、40、80μl/ml的培養(yǎng)基3ml分別染毒24 h；每組設3個平行。染毒結束后，胰酶消化，離心（2000轉，5min）收集細胞，用PBS洗滌細胞2次（2000轉，5min），加入500μL 的Binding Buffer 懸浮細胞；加入5μL Annexin V-FITC混勻后，加入5μL Propidium Iodide，混勻。室溫，避光，反應15min。用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長E

10、x=488nm；發(fā)射波長Em=530nm。Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測；PI紅色熒光通過PI通道（FL2或FL3）檢測。</p><p>　　1.2.3 通關藤對U937細胞Bax、Bcl-2 和 p53表達影響</p><p>　　同以上染毒方法獲取細胞，trizol法提取總RNA，用RT-PCR 方法檢測腫瘤細胞Bax、Bcl-2 和 p53基因

11、表達。設計引物如下：Bax引物：上游：5’-GGTGCCTCAGGATGCG-3’，下游：5’-GGAGTCTGTGTCCACG-3’，擴增片段115bp；Bcl-2引物：上游：5-TCGATGTGATGCCTCTGCGAAGAAC-3’，下游：5’-ATTGCACTGCCAAACGGAGCTG -3’，擴增片段112bp；以β-actin為參比基因：上游：5’-ATCCGCAAAGACCTGT-3’，下游：5’-GGGTGTAACGC

12、AACTAAG-3’，擴增片段293bp。反應條件：95℃預變性3 min，變性15s（95℃），退火1min（60℃），40個循環(huán)。</p><p>　　1.2.5 統(tǒng)計學方法</p><p>　　采用 SPSS 13. 0 軟件進行分析，資料以?x±s 表示，計量資料組間差異采用單因素方差分析。</p><p><b>　　2　結　果<

13、/b></p><p>　　2.1 通關藤對U937細胞的增值抑制作用</p><p>　　MTT結果顯示，對照組相比，不同染毒濃度下作用24h后的細胞相對增殖率低于對照組，，且具有統(tǒng)計學差異（表1） </p><p>　　表1 U937細胞在通關藤不同濃度作用24h后的吸光度(x±s,%)</p><p>　　*與對照組

14、相比，P&lt;0.05.</p><p>　　2.2 通關藤對U937細胞的凋亡作用</p><p>　　根據(jù)流式細胞儀檢測結果，隨著通關藤濃度的增高，U937的凋亡率在10~80μL/ mL時分別為4.67%、6.8%、11.93%、20.70%，且隨著通關藤濃度上升而逐漸上升，與對照組相比具有統(tǒng)計學差異(表2)。</p><p>　　表2 U937

15、細胞在通關藤不同濃度作用24h后凋亡率（100%）</p><p>　　*與對照組相比，P&lt;0.05.</p><p>　　2.3 通關藤對U937細胞Bax、Bcl-2和 p53表達影響</p><p>　　10、20、40μL/ mL通關藤作用24h后, U93細胞bax、bcl-2、p53基因表達水平均有所上調，Bax的mRNA相對表達水平分別為

16、1.52、2.48、3.78，隨著濃度上升而表達上升，且與對照組相比具有統(tǒng)計學差異，Bcl-2的相對表達水平為1.13、0.96、0.85，Bax/bcl-2值則分別為1.35、2.58、4.45，P53的相對表達水平為1.57、2.36、3.57，與對照組相比具有統(tǒng)計學差異(表3)。</p><p>　　表3 不同濃度通關藤作用24h后對U937細胞bax,bcl-2,p53基因相對表達水平的影響</p

17、><p>　　*與對照組相比，p&lt;0.05.</p><p><b>　　3　討　論</b></p><p>　　現(xiàn)代干細胞理論認為，白血病是造血干祖細胞發(fā)生惡性變化所致的惡性增殖性疾病。各種類型的白血病通常有特征性的細胞遺傳學異常。本研究通過用通關藤對U937細胞進行體外染毒，研究其細胞凋亡效應，并且通過檢測bax、bcl-2、p5

18、3三個基因的mRNA表達水平來研究其可能機制。研究結果表明，通關藤對U937細胞具有增殖抑制效應，并能夠誘導U937細胞凋亡。RT-PCR結果顯示，bax/bcl-2的比值上調，p53的表達水平也上升。Bcl-2 和 Bax 是 Bcl-2 家族中兩個典型的抑凋亡和促凋亡蛋白，且二者通過形成同源或異源二聚體來調節(jié)細胞凋亡。當Bax形成同源二聚體時誘導細胞凋亡；Bax與 Bc1-2形成異源二聚體時則實現(xiàn)Bcl-2 抑制細胞凋亡的功能[6]

19、。Bax與Bcl-2的比值決定同源二聚體(Bax/Bax)與異源二聚體(Bcl-2/Bax) 的比值，這對決定細胞是否進入凋亡狀態(tài)有重要意義。P53有影響細胞周期，引導細胞凋亡作用。實驗中，P53的表達也隨通關藤濃度的增加而出現(xiàn)增加的趨勢。根據(jù)以上的結果分析，通關藤誘導HELF細胞凋亡的機制可能與Bax/ Bcl-2的上升，及p53的m</p><p><b>　　參考文獻：</b><

20、/p><p>　　[1] 孫玨, 沈建華, 朱美華, 等. 消癌平對人胃癌細胞治療作用的實驗研究[J]. 上海中醫(yī)藥大學學報, 2000, 14( 2) :41-43.</p><p>　　[2] 袁秀英. 范忠澤, 黃秀英. 消癌平注射液治療14例晚期胃癌的臨床觀察[J] . 上海醫(yī)藥, 1996, 6: 15-16.</p><p>　　[3] 王文榮, 崔生達,

21、曾黎明. 中藥消癌平配合超聲引導經皮射頻治療中晚期肝癌的Ⅱ期 臨床觀察 [J] . 中國中西醫(yī)結合雜志, 2003,23( 1) : 89-90.</p><p>　　[4] 李東, 歐陽建, 李翠萍, 等. 通關藤對白血病細胞U937,HL60細胞凋亡作用的實驗研究[ J] . 中國生化藥物雜志, 2008, 29( 1 ) :33-37.</p><p>　　[5] 李東, 歐陽建,

22、李翠萍, 等. 消癌平注射液對白血病細胞NB4作用的初步研究[J] . 中國生化藥物雜志,2007, 28( 4) :247-250.</p><p>　　[6] Lalier L，Cartron PF，Juin P，et a1. Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis[J]. Apoptosis，2007, 12(5): 887－