土星擬威爾酵母WC91-2菌株β-1,3-葡聚糖酶基因的敲除.pdf

1、一些海洋致病酵母菌能夠引起海洋動物的疾病,給海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。研究表明,嗜殺酵母能夠應(yīng)用于抑制動、植物中病原酵母菌的生長,作為一種有效控制病原酵母菌的方法已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。海洋嗜殺酵母Williopsis saturnus WC91-2分離于海底沉積物,具有較廣的抗菌譜,對于能夠引起梭子蟹“乳化病”的Metschnikowia bicuspidate WCY抑制作用強(qiáng)烈。研究發(fā)現(xiàn)該菌株的β-1,3-葡聚糖酶與其產(chǎn)生的嗜

2、殺因子之間存在抑制作用。為了提高該嗜殺酵母菌的嗜殺活性,敲除其β-1,3-葡聚糖酶基因是很有必要的。
　　 將Zeocin基因作為標(biāo)記基因,構(gòu)建敲除編碼β-1,3-葡聚糖酶基因WsEXG1的敲除載體pMD19-WsEXG1-Zeocin,該敲除載體包含有WsEXG1基因啟動子:Zeocin基因:WsEXG1基因終止子的片段,然后將敲除載體轉(zhuǎn)化野生型菌株WC91-2。β-1,3-葡聚糖酶酶活的測定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化菌株的β-1,3-葡聚

3、糖酶酶活普遍低于野生型菌株的,最低達(dá)到0.71U／mL,同時轉(zhuǎn)化菌株的嗜殺活性也普遍增強(qiáng),抑菌圈直徑由野生型菌株的9±0.6mm增大到13±0.5mm。
　　 為了獲得WsEXG1基因完全被敲除的純合子,在一定條件下誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化菌株產(chǎn)生子囊孢子并萌發(fā)形成子囊孢子菌落。通過對不同子囊孢子菌落β-1,3-葡聚糖酶活性的測定,篩選出酶活最低的一株命名為WC91-2-2,測定其β-1,3-葡聚糖酶酶活為0.45U／mL,該菌株比野生型菌株產(chǎn)

4、生更多的嗜殺因子。PCR檢測顯示Zeocin基因插入到W.saturnus WC91-2-2 WsEXG1基因的開放閱讀框中。
　　 以葡萄糖作為碳源,采用單次因子方法對敲除菌株搖瓶產(chǎn)嗜殺因子培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,得到最適產(chǎn)嗜殺因子的培養(yǎng)基組分是(w／v):葡萄糖1.0％,酵母粉3.0％,NaCL濃度0％,培養(yǎng)基初始pH為4.5。最佳培養(yǎng)條件為:在24℃和180 rpm下振蕩培養(yǎng)72 h。在此最佳條件下培養(yǎng),敲除菌株的嗜殺因