甜菜BvM14-MADSbox基因啟動子的克隆及瞬時表達(dá)分析.pdf

1、甜菜M14品系是通過二倍體栽培甜菜和野生白花甜菜進(jìn)行種間雜交及回交，在其后代中篩選出的附加了白花甜菜9號染色體的單體附加系，附加的染色體平均傳遞率為96.5％。M14品系具有兼性無融合生殖的特性，是克隆無融合生殖相關(guān)基因極其難得的實驗材料。本實驗室前期通過抑制消減雜交技術(shù)(SSH)和RACE技術(shù)得到了甜菜M14特異表達(dá)基因BvM14—MADSbox的cDNA全長。通過生物信息學(xué)分析以及該基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的組成型表達(dá)已初步證實BvM14

2、—MADSbox基因?qū)儆贛ADS—box基因家族，在植物花各輪器官的分化發(fā)育及調(diào)控花期中起作用。由于MADS—box基因在植物體生長發(fā)育過程中起到重要的調(diào)控作用，而且它在植物體不同的發(fā)育階段有不同的時空表達(dá)模式，如果利用轉(zhuǎn)基因研究中載體常用的組成型啟動子35S驅(qū)動BvM14—MADSbox基因在植物各組織中恒定持續(xù)的表達(dá)，不能從時間和空間上進(jìn)行有效調(diào)控，會存在一些缺陷。因此，為進(jìn)一步深入研究BvM14—MADSbox基因的功能以期揭示該

3、基因的表達(dá)特性，克隆出其啟動子具有十分重要的意義，它可為今后分析BvM14—MADSbox基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及利用BvM14—MADSbox自身特有的啟動子調(diào)控該基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，從而突破外源基因組成型表達(dá)的局限奠定基礎(chǔ)。 本研究利用染色體步移的方法從甜菜M14品系基因組DNA中克隆到BvM14—MADSbox基因起始密碼子上游1870bp的序列。通過在線分析軟件http：//www．fruitfly．org/seq_to

4、ols/promoter．html對該序列分析，預(yù)測出轉(zhuǎn)錄起始位點為A，位于起始密碼子上游152bp處。通過Plant CARE http：//bioinformatics．psb。ugent．bet/webtools/plantcare/html/在線分析，BvM14—MADSbox啟動子中含有的順式作用元件，結(jié)果表明該序列中除了包括TATA—box、CAAT—box等典型的真核生物順式調(diào)控元件外，還含有ARE、ABRE、ERE等重要

5、的順式調(diào)控元件和一些光反應(yīng)相關(guān)的元件以及抗寒抗旱誘導(dǎo)元件。進(jìn)一步通過PCR的方法擴(kuò)增了4個BvM14—MADSbox啟動子5’缺失片段，分別命名為p1700、p1200、p700和p300。將4個缺失片段分別替換植物表達(dá)載體pBI121上的35S啟動子，構(gòu)建了4個以GUS為報告基因的缺失表達(dá)載體，分別為pBI-P1700，pBI-P1200，pBI-P700和pBI-P300。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將4個缺失表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草葉片。GUS