鴨甲型肝炎病毒RT——PCR檢測(cè)方法的建立及華東地區(qū)2009-2011年鴨甲型肝炎病毒的流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是危害養(yǎng)鴨業(yè)的一種急性高度致死性傳染病。病原包括小RNA病毒科禽肝病毒屬的鴨甲肝病毒(Duck hepatitis Avirus,DHAV)和星狀病毒科禽星狀病毒屬的鴨星狀病毒(Duck astrovirus,DAstV)。DHAV分為三個(gè)型,即1型(DHAV-1)、2型(DHAV-2)和3型(DHAV-3),分別對(duì)應(yīng)以往所稱的鴨肝炎病毒血清1型(DHV-1)以及2007年

2、報(bào)道的臺(tái)灣DHV新型和韓國DHV新型。
　　 為了解華東地區(qū)鴨肝炎病毒的流行情況,本研究建立了檢測(cè)DHAV的RT-PCR方法,應(yīng)用該方法檢測(cè)了從江蘇、山東、安徽地區(qū)采集疑似感染鴨病毒性肝炎臨床樣品,并對(duì)樣品進(jìn)行病毒分離鑒定、VP1基因遺傳進(jìn)化分析,為鴨病毒性肝炎的防控提供了快速檢測(cè)方法和指導(dǎo)作用。
　　 1.鴨甲型肝炎病毒RT-PCR檢測(cè)方法的建立
　　 參考GenBank中已發(fā)表的DHAV-1和DHAV-3的全

3、基因組序列,利用PrimerPremier5.0軟件,針對(duì)VP1上、下游附近保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)兩對(duì)特異引物,建立了DHAV-1和DHAV-3的RT-PCR檢測(cè)方法。用該方法對(duì)DHAV-1 YZ株和DHAV-3JD株進(jìn)行檢測(cè),成功擴(kuò)增出大小分別為720bp和950bp的目的條帶,而與禽流感病毒、鴨瘟病毒、鴨疫里默氏桿菌無交叉反應(yīng),具有較好的特異性;能分別檢測(cè)出RNA模板含量下限為5.2ng和6.8ng的DHAV-1和DHAV-3,具有較好的

4、敏感性。因此該方法可用于DHAV的快速診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查。
　　 2.2009-2011華東地區(qū)鴨甲型肝炎病毒的分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析
　　 用該方法對(duì)臨床疑似鴨肝炎病毒感染的病料進(jìn)行檢測(cè),從15份病料中成功檢測(cè)到15份DHAV-1和5份DHAV-3,因此,15份病料中有10份為DHAV-1單獨(dú)感染,占66.7％;5份為DHAV-1和DHAV-3混合感染,占33.3％。病料經(jīng)處理后通過鴨胚尿囊腔接種,得到15個(gè)分離株

5、。以DHAV-1引物擴(kuò)增15株DHAV VP1,并進(jìn)行序列測(cè)定和繪制遺傳進(jìn)化樹,結(jié)果表明所有毒株均與血清1型的參考毒株處于同一分支上,以DHAV-3引物擴(kuò)增YN和DHV012個(gè)分離株的VP1,序列測(cè)定和繪制遺傳進(jìn)化樹,結(jié)果表明這2個(gè)毒株與韓國DHAV-3及國內(nèi)分離的DHAV-3同屬于一個(gè)基因型。用己發(fā)表的針對(duì)3D基因序列的引物擴(kuò)增這2個(gè)毒株,繪制的遺傳進(jìn)化樹與VP1的一致。
　　 以雞胚適應(yīng)株YZ株制備的雞抗DHAV-1陽性血清