OsMKK1、OsMPK4調(diào)節(jié)水稻的鹽脅迫反應(yīng)及SS12鹽敏感突變體的篩選和初步定位.pdf

1、土壤的鹽堿化已成為公認的影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的嚴重問題，全世界大約有1/5的農(nóng)田都受高鹽堿化影響。土壤的鹽堿化會阻礙植物的生長和發(fā)育，主要通過滲透脅迫、離子平衡和離子毒害等，其中離子毒害主要是鈉離子引起的。但是植物是如何感受鹽脅迫和整個信號轉(zhuǎn)導途徑我們了解的還很少。利用突變體來研究某些基因在這個過程中的作用，是很重要的手段。
　　1.在植物中MAPK信號通路廣泛參與了脅迫信號。首先利用熒光定量PCR對OsMKK家族中的7個成員進行鹽脅迫下

2、0-8小時的表達分析，發(fā)現(xiàn)OsMKK1在鹽處理一小時后表達量變化很大。選取了OsMKK1作為研究對象，通過對比osmkk1突變體和野生型經(jīng)過鹽處理后地上部的鈉離子含量及存活率的變化發(fā)現(xiàn)，水稻osmkk1突變體變得對鹽脅迫非常敏感，地上部積累了更高的鈉離子，當鹽處理7天后，復水7天，與野生型相比osmkk1突變體存活率非常低。
　　選取3個能夠被鹽脅迫誘導表達的MPK基因，即OsMPK3，OsMPK4和OsMPK7，在原核中表達，并

3、用它們作為底物測定原生質(zhì)體中OsMKK1的活性，發(fā)現(xiàn)OsMPK3，OsMPK4都能被OsMKK1激活。OsMPK4也在以后的實驗中被選作底物來測定OsMKK1的活性。在原生質(zhì)體中表達帶Flag標簽的OsMKK1，然后利用Flag抗體免疫共沉淀出OsMKK1利用GST-OsMPK4作為底物測定OsMKK1在原生質(zhì)體鹽處理10分鐘的活性，發(fā)現(xiàn)它的活性顯著增高。用OsMKK1抗體從鹽處理后的水稻幼苗中免疫共沉淀出OsMKK1，測定植株中的Os

4、MKK1活性在鹽脅迫下的變化，發(fā)現(xiàn)鹽處理OsMKK1活性跟在原生質(zhì)體中的結(jié)果一致，都出現(xiàn)了顯著地升高，并且還在2個小時內(nèi)保持著高活性。
　　通過酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)，OsMPK4是OsMKK1的一個作用靶蛋白，并且有很強的相互作用。利用酵母MPKK突變體pbs2來進行酵母功能互補實驗發(fā)現(xiàn)，OsMKK1及其下游的OsMPK4能夠一起互補酵母突變體pbs2中MPKK基因缺失所導致的鹽敏感表型。當時發(fā)現(xiàn)只有OsMPK4或OsMKK1單獨表達時

5、是不能互補表型的，這表明OsMPK4和OsMKK1有相互作用，OsMPK4是依靠OsMKK1來起作用的。
　　為了探尋OsMPK4與鹽脅迫信號傳導的作用，測定了原生質(zhì)體和植株中OsMPK4的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsMPK4也能被鹽脅迫激活，并且在osmkk1突變體中OsMPK4活性提高所保持的時間更短。在原生質(zhì)體中過表達OsMKK1能夠增加OsMPK4的活性。
　　MPK基因在植物逆境中的作用的研究早就發(fā)現(xiàn)能夠影響基因的表達，其

6、中包括轉(zhuǎn)錄因子。通過熒光定量PCR檢測了在鹽脅迫下幾個逆境相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子OsDREB2A,OsDREB2B,OsNAC6,OsTRAB1,OsABI5,OsbZIP23和OsMYBS3在野生型和突變體osmkk1中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsMYB3S，OsNAC6，OsDREB2B和OsDREB2A在突變體中的表達升高受到了抑制。
　　綜上所述，OsMKK1和OsMPK4組成的信號通路參與了水稻鹽脅迫的信號轉(zhuǎn)導，并且調(diào)節(jié)了水稻對鹽

7、脅迫的抵抗能力。
　　2.利用化學誘變劑EMS制作日本晴背景的突變體，并從中篩選鹽敏感突變體，然后利用圖位克隆技術(shù)進行定位。
　　本研究利用粳稻測序品種日本晴，用EMS作為誘變劑。從突變體庫中篩選得到一份對鹽敏感的突變體材料SS12(saltsensitive12)，對其進行鹽處理后發(fā)現(xiàn)，SS12在鹽脅迫下葉尖很快萎蔫變黃，同時通過測定幼苗體內(nèi)的鈉鉀離子含量發(fā)現(xiàn)，SS12能夠在地上部積累更多的鈉離子和鉀離子，在地下部差異不明

8、顯。通過比較SS12和野生型傷流中的鈉鉀離子含量發(fā)現(xiàn)，SS12在傷流中的鈉離子含量也比野生型明顯上升。這說明了突變體SS12能夠在地上部積累高濃度的鈉離子可能與能夠往地上部運輸更多的鈉離子有關(guān)。
　　通過分析掃描電鏡X射線能譜發(fā)現(xiàn)，鹽處理后，在SS12根、葉中的的薄壁組織和木質(zhì)部中，鉀元素并沒有像野生型中下降的那么明顯。分析掃描電鏡的掃描圖片發(fā)現(xiàn)，SS12幼苗根部的次生木質(zhì)部的數(shù)量上有明顯差異，SS12次生木質(zhì)部只有1根導管，而野

9、生型絕大部分次生木質(zhì)部有2根導管。
　　利用基因芯片分析了鹽處理前后，野生型和突變體體內(nèi)基因表達的變化。分地上部和地下部來取樣。通過分析發(fā)現(xiàn)，野生型和突變體基因表達的差異主要集中在地下部。對地下部的表達差異進行GO(GeneOntology)的富集分析。富集較多差異基因GO種類比較相似。針對鹽處理前后，突變體比野生型根部表達都上升的80個基因和都下降的109個基因進行了重點的分析，對變化的一部分基因編號和功能進行了進一步的闡釋，結(jié)

10、果發(fā)現(xiàn)跟激素合成比如赤霉素GA合成相關(guān)的一部分基因，PCD相關(guān)基因，POD類基因，萌蛋白類的基因和細胞壁受體激酶WAK類的基因都多次出現(xiàn)。對這些基因分析發(fā)現(xiàn)他們很多都可能與次生木質(zhì)部的形成有關(guān)。
　　利用SS12/明恢63和SS12/窄葉青8號的雜交組合F2∶3后代進行初定位，從SS12和/明恢63的F2∶3群體中250個株系利用檢測到有多態(tài)的140對SSR引物對親本SS12及明恢63窄葉青8的全基因進行掃描，尋找與鈉離子含量連鎖