大白菜幾丁質(zhì)酶基因CHB4的克隆與表達分析.pdf

1、幾丁質(zhì)酶是一種能催化真菌細胞壁的重要成分—幾丁質(zhì)降解的糖苷酶，普遍存在于大白菜、煙草等高等植物中，因在抑制真菌的生長增殖、提高植物的抗病性等方面具有重要作用，現(xiàn)已成為當(dāng)前科學(xué)研究的熱點之一。本文通過PCR反應(yīng)及RACE技術(shù)，從大白菜基因組DNA及RNA中分別擴增出大白菜幾丁質(zhì)酶全基因及成熟肽基因，并對其進行了生物信息學(xué)分析；構(gòu)建原核表達載體pET-CHB4，通過IPTG誘導(dǎo)并對該基因表達的蛋白產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析、生物活性和功能

2、分析。結(jié)果表明： 1.根據(jù)已知十字花科植物幾丁質(zhì)酶基因的保守序列設(shè)計特異性引物，以大白菜葉片基因組DNA為模板，通過PCR反應(yīng)擴增出長度約為1Kb的特異性DNA片段和幾丁質(zhì)酶N端序列片段(150bp)。選取經(jīng)1mmol.L-1水楊酸處理后的大白菜植株葉片提取RNA，利用RACE技術(shù)擴增該基因的3'端436bp。 2.以大白菜葉片基因組DNA為模板，利用PCR反應(yīng)擴增出長度為1517bp的幾丁質(zhì)酶全基因；以水楊酸誘導(dǎo)的大白

3、菜葉片RNA為模板，通過RT-PCR反應(yīng)擴增出長度為811bp幾丁質(zhì)酶成熟肽基因。 3.生物信息學(xué)分析表明，該幾丁質(zhì)酶基因全長1517bp，其中內(nèi)含子序列長度為508bp(DDBJ登錄號為AB257452)，編碼由268個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)(pI/Mw：8.28/28701.23，www.expasy.org)。與其他物種ClassⅣ類幾丁質(zhì)酶氨基酸序列的多重比較表明(DNAMAN)，與油菜ClassⅣ類幾丁質(zhì)酶的同源性達9

4、9％，與其他已知高等植物ClassⅣ類幾丁質(zhì)酶的同源性達50％以上。說明所克隆的大白菜幾丁質(zhì)酶基因是編碼ClassⅣ類幾丁質(zhì)酶的基因。 4.構(gòu)建了原核表達載體pET-CHB4，利用IPTG誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE分析表明，該基因表達的蛋白分子量為28kD左右，其表達產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。 5.通過改變誘導(dǎo)表達的參數(shù)發(fā)現(xiàn)，25℃的低溫并不能改變表達蛋白的可溶性，而在pH9.5的培養(yǎng)基條件下，表達產(chǎn)物的上清液中卻有重

5、組蛋白條帶出現(xiàn)，表明堿性環(huán)境有利于蛋白質(zhì)的折疊和二硫鍵的交換。 6.以酵母菌為指示菌做抑菌圈試驗，結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達的蛋白液處理后，抑菌圈大小變化明顯，當(dāng)IPTG濃度為0.6mmol/L時抑菌效果最佳。 7.通過對不同IPTG誘導(dǎo)表達的幾丁質(zhì)酶活力的測定，結(jié)果表明，當(dāng)IPTG濃度為0.6mmol/L時，幾丁質(zhì)酶活力達到最大值2.8U，明顯高于原菌液幾丁質(zhì)酶活力1.2U。 綜上所述，本文成功地從