小菜蛾腺苷受體基因PxAdoR在N6(2-羥乙基)腺苷殺蟲過程中的作用研究.pdf

1、利用蟲生真菌或其毒力因子來防治害蟲是害蟲生物防治研究的熱點之一，關(guān)鍵問題是要揭示病原真菌的毒力因子如何作用于昆蟲。蟬花蟲草（Isaria cicadae Mique），其代謝產(chǎn)物N6(2-羥乙基)腺苷[N6-(2–hydroxyethyl)-adenosine，HEA]對小菜蛾具有一定的殺蟲活性，表現(xiàn)為蟬花蟲草分生孢子寄生小菜蛾類似的拒食，發(fā)育遲緩和致死等現(xiàn)象。本文利用前期抑制性消減雜交法得到的差異表達(dá)片段設(shè)計特異性引物，克隆小菜蛾腺苷

2、受體（Plutella xylostella adenosine receptor，PxAdoR）基因。并根據(jù)克隆得到的全長序列設(shè)計特異性引物合成含有目的基因片段的dsRNA進(jìn)行RNAi，通過熒光定量PCR分析HEA對PxAdoR基因相對表達(dá)量的影響。利用HEA及哺乳動物腺苷受體A2aR抑制劑SCH58261處理小菜蛾2齡幼蟲結(jié)合RNAi技術(shù)研究HEA與PxAdoR受體之間的作用關(guān)系。主要結(jié)果如下：
　　1.腺苷受體基因PxAdo

3、R克隆及特征分析
　　利用HEA作用于小菜蛾獲得差異表達(dá)的片段設(shè)計特異性引物，采用RT–PCR和RACE技術(shù)從小菜蛾中克隆全長1828 bp的小菜蛾腺苷受體基因，并通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測和分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),顯示其蛋白分子量為49.2 kDa，沒有信號肽，疏水性不穩(wěn)定蛋白，并且具有7次跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的一類G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor，GPCRs)。并通過NCBI比對發(fā)現(xiàn)與哺乳動物的腺苷受體存在差異

4、與昆蟲腺苷受體更相似。
　　2. HEA激活PxAdoR對小菜蛾致死率和體重增長的影響
　　根據(jù)克隆得到的全長序列設(shè)計特異性引物合成含有目的基因片段的dsRNA，通過喂食的方法導(dǎo)入小菜蛾二齡幼蟲體內(nèi)，起到抑制目的基因PxAdoR表達(dá)的作用，再通過1 mg/ml的HEA連續(xù)喂食60 h，并取樣通過熒光定量PCR檢測經(jīng)過HEA處理后PxAdoR相對表達(dá)量情況。結(jié)果表明：HEA處理后PxAdoR基因的表達(dá)量與對照組有極顯著差異，比

5、對照組高了4.3倍，而通過喂食dsRNA后再經(jīng)過HEA處理的小菜蛾與CK組比有顯著的升高，但比HEA組低。表明HEA能有效激活PxAdoR基因的表達(dá)。
　　1 mg/ml的HEA對小菜蛾二齡幼蟲具有明顯的致死性，而施加包含目的基因的雙鏈RAN（PxAdoR–dsRNA）或喂食腺苷受體抑制劑SCH58261在36，48,60h能明顯降低HEA對小菜蛾幼蟲的死亡率和體重增長抑制率。特別是在48 h處，喂食雙鏈RNA的RNAi干擾組的體