2008-2009年乙型腦炎病毒分離及其生物學(xué)特性分析.pdf

1、日本腦炎病毒（Japanese Encephalitis virus，JEV），又稱(chēng)乙型腦炎病毒（簡(jiǎn)稱(chēng)乙腦病毒），是黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）的一員，主要引起人類(lèi)或馬的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染以及豬的流產(chǎn)，能通過(guò)持續(xù)感染的蚊子傳播給人，并且主要在脊椎動(dòng)物宿主內(nèi)存在，特別是具有較高病毒血癥的豬和鳥(niǎo)類(lèi)。在人類(lèi)乙腦主要引起致死率較高的腦炎，致死率在20-50％之間，但是絕大多數(shù)的幸存者都留有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的后遺

2、癥，在家養(yǎng)動(dòng)物如豬和馬，主要引起腦炎、流產(chǎn)甚至死亡。豬是主要中間宿主和擴(kuò)散宿主，也是主要的傳染源。同時(shí)，近些年全球乙腦流行區(qū)域呈現(xiàn)擴(kuò)大之勢(shì)，我國(guó)乙腦發(fā)病地區(qū)也有明顯擴(kuò)展。WHO已將乙腦納入全球重點(diǎn)防控疾病。許多研究表明，豬流行性乙型腦炎與人流行性乙型腦炎密切相關(guān)，預(yù)防豬感染乙腦是防控人患乙腦的重要措施，因群中流行性乙型腦炎病原學(xué)調(diào)查和流行的乙腦病毒株分子生物學(xué)特性研究尤為重要，更為開(kāi)發(fā)豬源的乙腦疫苗打下基礎(chǔ)。鑒于此病的流行和傳播特點(diǎn)，本

3、實(shí)驗(yàn)首次嘗試了新的分離乙腦病毒的方法，全面的分析了當(dāng)前在我國(guó)上述五個(gè)省市流行的乙腦病毒的流行特點(diǎn)和分子生物學(xué)特性.論文的主要研究?jī)?nèi)容主要包括以下幾個(gè)方面：
　　 1病毒分離
　　 從江蘇、浙江、上海、山東和安徽5個(gè)省市不同的58家豬場(chǎng)采集蚊子、病豬血液和發(fā)病公豬精液，蚊子樣品存放輕便液氮灌保存和運(yùn)輸，血液和精液冷藏運(yùn)輸，送實(shí)驗(yàn)室后立即處理采集病料，結(jié)合BHK-21細(xì)胞傳代和乳鼠腦內(nèi)接種盲傳病毒，細(xì)胞上盲傳4-5代后出現(xiàn)規(guī)

4、則細(xì)胞病變（CPE），小鼠腦內(nèi)接種引起神經(jīng)癥狀或表現(xiàn)為乙腦癥狀者保存毒種。結(jié)果從58份病料中分離出疑似病毒21株.
　　 2分離病毒的鑒定
　　 在鋪滿單層BHK-21細(xì)胞的96孔板上做間接免疫熒光，用羊抗兔的熒光抗體（IgG-FITC）染色，在熒光顯微鏡下觀察鑒定；參考GenBank中乙腦病毒基因序列，利用DNAstar（version5.0）軟件找出一段保守序列，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)合成JEV M區(qū)基因的一

5、對(duì)特異性檢測(cè)引物，通過(guò)PT-PCR擴(kuò)增條帶，測(cè)序鑒定；進(jìn)而根據(jù)JEV（M-E）區(qū)基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增條帶，回收產(chǎn)物、連接PMD-18T載體并測(cè)序。結(jié)果從21份疑似病毒株中分離出15株乙腦病毒。
　　 3分離病毒株的生物學(xué)特性分析
　　 根據(jù)Woan-Ru Chen建立的方法進(jìn)行基因分型分析。結(jié)果顯示本次實(shí)驗(yàn)所分【離的15株乙腦病毒均屬于基因型Ⅲ型；新分離15株病毒E蛋白的氨基酸和核苷酸之間的同源性

6、較高，核苷酸同源性為99％-99.90％，氨基酸同源性為97.8％-100％。15株新分離毒株與乙腦病毒疫苗株P(guān)3株比較，氨基酸的同源性為96％-97％；與弱毒疫苗株SA14-14-2株比較，氨基酸的同源性為96.8％-98％。所有毒株在核苷酸序列上的差異均為堿基的替換，所有核苷酸或氨基酸均無(wú)插入或丟失。大多數(shù)核苷酸變異在氨基酸編碼的第三位，屬于沉默突變，不引起氨基酸改變。新分離病毒經(jīng)噬斑純化、鼠腦接種和連續(xù)5次細(xì)胞傳代后，病毒在BHK

7、-21細(xì)胞上的繁殖特性趨于穩(wěn)定，新分離15株乙腦病毒在感染BHK-21細(xì)胞后都能使細(xì)胞發(fā)生變圓、量度增加，拉網(wǎng)、脫落等特異性的細(xì)胞病變（CPE），產(chǎn)生病變時(shí)間穩(wěn)定在48小時(shí)左右；在BHK-21細(xì)胞上有相似的病毒滴度（106.1-106.8TCID50）；對(duì)9-11g小鼠腦內(nèi)接種30ul，104TCID50的新分離病毒，得到不同的致死率（60％-80％）。結(jié)果表明：在相同時(shí)間相同地理位置分離的乙腦病毒有非常高的同源性，但是隨著時(shí)間和地理位