豬鏈球菌多重PCR檢測(cè)方法的建立及屠宰場(chǎng)樣品感染率的調(diào)查研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis, SS)是一種重要的人獸共患病原菌,主要引起豬和人類(lèi)的腦膜炎、敗血癥及突發(fā)性死亡,對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失的同時(shí),嚴(yán)重威脅人類(lèi)公共衛(wèi)生安全。根據(jù)菌體莢膜多糖抗原特性的不同,可分為35個(gè)血清型(1～34型,1/2型),其中以2型流行最廣、致病性最強(qiáng),其次是7型和9型。目前研究認(rèn)為SS致病性與其相關(guān)毒力因子的攜帶與表達(dá)密切相關(guān)。本研究首先根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)菌株建立多重PCR方法并對(duì)方法進(jìn)行評(píng)價(jià),隨后根據(jù)所建

2、立方法初步設(shè)計(jì)了檢測(cè)試劑盒;應(yīng)用本研究所建立的多重PCR方法對(duì)分離自扁桃體樣品中的豬鏈球菌進(jìn)行分型與毒力因子的檢測(cè),并用斑馬魚(yú)模型對(duì)12株SS2的致病力進(jìn)行了比較。一、豬鏈球菌2、7、9型多重PCR檢測(cè)方法建立與應(yīng)用根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及Genbank上豬鏈球菌序列,設(shè)計(jì)合成10對(duì)引物,通過(guò)在3個(gè)PCR反應(yīng)體系中的組合優(yōu)化,建立了一種涵蓋7種豬鏈球菌主要毒力因子mrp、epf、sly、gdh、gapdh、orf2和fbps及2、7、9型分型的多

3、重PCR檢測(cè)方法。特異性和敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明該法特異性強(qiáng),多重PCR敏感性可達(dá)103CFU。最后根據(jù)所建立方法設(shè)計(jì)組裝試劑盒并擬定操作說(shuō)明書(shū),通過(guò)重復(fù)性試驗(yàn)和保存期試驗(yàn),證明試劑盒的批內(nèi)、批間重復(fù)性好,可在-20℃條件下保存4個(gè)月。二、扁桃體樣品中豬鏈球菌的調(diào)查與2型分離菌株的毒力比較2008年-2009年期間,分別在上海、安徽和廣東三地屠宰場(chǎng)采集屠宰后豬的扁桃體樣品,對(duì)所采399份樣品中豬鏈球菌的攜帶率以及血清分型進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果

4、顯示SS總體陽(yáng)性率(16S rRNA+)為9.27％(37份);分離到23株SS。其中2型有16株、7型有3株和9型有4株;14份(3.5%)樣品16S rRNA陽(yáng)性但具體血清型待定。所有2型分離菌株中,有9株毒力因子表型為mrp+epf+fbps+gdh+orf2+sly+ gapdh+;其它分離菌株均存在不同毒力因子缺失。隨后選用800多尾斑馬魚(yú)(Danio rerio)對(duì)上述9株2型分離菌株以及SH-07YH、ZY05719和HA