苯丙氨酸解氨酶基因遺傳轉(zhuǎn)化水稻的研究.pdf

1、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Ammonia—lyase，PAL)是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，也是類黃酮生物合成途徑的限速酶，它的活性與黃酮類化合物的形成呈正相關(guān)。黃酮類化合物具有抗腫瘤、防癌抗癌、抗心血管疾病、抗氧化和延緩衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗糖血病等重要的藥理作用，人體不能合成黃酮類化合物，主要從食物中攝取。
　　 本研究采用基因工程技術(shù)，從本實(shí)驗(yàn)室篩選出的黃酮類物質(zhì)含量特高水稻優(yōu)異種質(zhì)“M—1”中克隆的PAL

2、基因，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入到其它類黃酮含量低稻谷產(chǎn)量高的水稻中，使其在胚乳特異表達(dá)，期望選育出稻谷產(chǎn)量高且類黃酮含量高的水稻新品系。主要的研究結(jié)果如下：
　　 1、植物表達(dá)載體PCDMAR—PAL—Hyg的構(gòu)建：構(gòu)建了含有PAL基因的雙T—DNA植物表達(dá)載體的構(gòu)建PCDMAR—PAL—Hyg，該載體含有兩段相互獨(dú)立的T—DNA區(qū)域，其中一個(gè)T—DNA區(qū)域含有目的基因PAL，另外一個(gè)T—DNA區(qū)域含有標(biāo)記基因Hyg。該植物表達(dá)載體

3、選用胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子Gtl，驅(qū)動(dòng)PAL基因的表達(dá)，在PAL基因的兩側(cè)連接的兩段正向重復(fù)Rb7MARs序列能增強(qiáng)PAL，基因的表達(dá)。
　　 2、無(wú)Hyg標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得：采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將植物高效表達(dá)載體PCDMAR—PAL—Hyg導(dǎo)入到水稻品種“TG—9”、“527”、“MH86”中，獲得“TG—9”轉(zhuǎn)基因植株153株，經(jīng)PCR篩選27株呈陽(yáng)性；獲得“527”轉(zhuǎn)基因植株7株，經(jīng)PCR篩選3株呈陽(yáng)性；獲得“MH86”

4、轉(zhuǎn)基因植株4株，經(jīng)PCR篩選1株呈陽(yáng)性。對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株單酶切基因組DNA進(jìn)行Southern雜交，結(jié)果表明目的基因已整合到水稻基因組中，但不同的轉(zhuǎn)基因植株中目的基因有不同的插入位點(diǎn)和拷貝數(shù)。對(duì)“TG—9”T1代植株進(jìn)行PCR鑒定，成功篩選出了含有PAL基因而無(wú)Hyg標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因水稻。
　　 3、利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，測(cè)定了“TG—9”T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因稻米中總黃酮的含量。與對(duì)照植株的總黃酮含量相比，有26株的轉(zhuǎn)基因植株的總黃