豬流感病毒H-,3-N-,8-亞型NA基因的克隆和原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立.pdf

1、本研究采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增A/Swine/Anhui/01/06(H3N8)亞型豬流感病毒神經(jīng)氨酸酶NA基因，然后將該基因克隆到pET-28a(+)原核表達(dá)載體中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-NA；經(jīng)用PCR、雙酶切和DNA核苷酸序列測定等方法鑒定，得到陽性重組質(zhì)粒；再將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中，用卡那霉素抗性篩選得到穩(wěn)定表達(dá)的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21；在37℃，1mmol/LIPTG誘導(dǎo)3h條件下宿主菌B

2、L21成功表達(dá)重組蛋白；表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，重組蛋白主要以包涵體的形式存在，改變IPTG濃度和降低誘導(dǎo)溫度，無法使目的蛋白可溶性表達(dá)；將轉(zhuǎn)化后宿主菌BL21在不同IPTG濃度和不同培養(yǎng)時間下進(jìn)行誘導(dǎo)，得到表達(dá)NA基因的最佳誘導(dǎo)濃度為1mmol/L和最佳誘導(dǎo)時間為6h；表達(dá)蛋白經(jīng)尿素變性與復(fù)性，得到純化的可溶性重組蛋白。用Westernblot分析表明，表達(dá)產(chǎn)物能與H3N8亞型豬流感病毒(SIV)感染豬陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，

3、具有良好的免疫學(xué)活性。
　　 以純化后的重組蛋白作為包被抗原建立了檢測H3N8亞型SIV抗體的間接ELISA方法。通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，得出間接ELISA最佳工作條件：抗原包被濃度為8.68×10-4↗↗μ↖↖g/ml；血清稀釋度為1:80；封閉液為5％脫脂乳；封閉時間為1.5h；一抗作用時間為0.5h；酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為1:1000；酶標(biāo)抗體作用時間為0.5h。陰陽性血清的判斷標(biāo)準(zhǔn)分別確定為OD630nm≤0.307和OD630

4、nm≥0.353。通過特異性試驗結(jié)果顯示，該方法與H1、H5亞型SIV以及豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病等相關(guān)豬病陽性血清無交叉反應(yīng)。通過重復(fù)性試驗表明，用同一批制備的重組蛋白包被ELISA板的批內(nèi)變異系數(shù)在3.60％～7.50％之間；用同一批制備的重組蛋白包被ELISA板的批間變異系在3.38％～7.89％之間。分別用已建立的間接ELISA方法和血凝抑制試驗(HI)對臨床豬血清檢測結(jié)果進(jìn)行對比。結(jié)果顯示，間接ELISA方法與血凝抑制