豬瘟抗體阻斷ELISA檢測(cè)方法的建立和對(duì)豬瘟活疫苗免疫效果的評(píng)價(jià).pdf

1、本研究將含有編碼豬瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因的重組桿狀病毒接種于SF9昆蟲細(xì)胞中，經(jīng)復(fù)壯和懸浮培養(yǎng)后收集細(xì)胞上清，過濾后用鎳柱做親和層析純化E2蛋白，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，在約53Kda處有一特異表達(dá)的蛋白帶，同豬瘟病毒E2蛋白的大小基本一致；Western-blot印跡表明，該蛋白帶能與豬瘟陽性血清發(fā)生特異反應(yīng)。將豬瘟單克隆抗體WH303株的雜交瘤細(xì)胞從液氮中取出復(fù)蘇，培養(yǎng)增殖后接種于BALB/C小鼠腹腔，5天后收獲含有單抗的腹水，并

2、測(cè)定其效價(jià)。腹水處理后用ProteinG親和層析純化單克隆抗體，經(jīng)SDS-PAGE鑒定后用過碘酸鈉法進(jìn)行標(biāo)記，測(cè)定酶標(biāo)抗體的濃度，并于-20℃凍存。
　　 以純化的E2蛋白和制備的酶標(biāo)單抗為基礎(chǔ)，建立了豬瘟抗體阻斷ELISA檢測(cè)方法。通過對(duì)ELISA各反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定了最佳反應(yīng)條件：E2蛋白的最佳包被濃度為0.09μg/rnl，最適包被條件為4℃16h;最佳封閉液為PBST+10％脫脂奶粉+Proclin300+5％海藻糖，

3、封閉條件為4℃16h;最佳血清稀釋液為PBST+5％奶粉，稀釋倍數(shù)為2倍，血清孵育時(shí)間為37℃1h;酶標(biāo)單抗的最佳工作濃度為0.37μg/ml，最佳酶標(biāo)單抗稀釋液為Peroxidase Conjugate Stabilizer，工作條件為25℃30min。采用優(yōu)化好的ELISA反應(yīng)條件，檢測(cè)了豬瘟抗體血清盤，將OD值用ROC曲線法進(jìn)行分析，得到本方法的陰陽血清判定值為：36％的抗體阻斷率，檢測(cè)灰區(qū)介于32％-40％的抗體阻斷率之間。對(duì)建

4、立的豬瘟抗體阻斷ELISA法進(jìn)行了性能評(píng)估，結(jié)果表明：本方法和常見的豬病毒抗體沒有交叉反應(yīng)；與IDEXX試劑盒相比較，其特異性和敏感性分別為：94.2％和98％;用本方法檢測(cè)“歐盟實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控品”，結(jié)果同IDEXX豬瘟抗體試劑盒的檢測(cè)結(jié)果一致；用免疫豬的血清評(píng)估本方法，顯示本方法和IDEXX試劑盒的相關(guān)性高于0.8。
　　 根據(jù)本方法的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)豬瘟弱毒疫苗的免疫劑量和免疫保護(hù)期進(jìn)行了研究。用1200RID、6000RID和24