調(diào)控DNMT1對(duì)胎牛成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖、周期、凋亡的影響.pdf

1、體細(xì)胞核移植技術(shù)作為一項(xiàng)發(fā)展日益成熟的技術(shù)，在很多領(lǐng)域都顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。但是，體細(xì)胞核移植技術(shù)的效率很低，這也成為了限制其發(fā)展的最大障礙，其中表觀遺傳修飾異常被認(rèn)為是導(dǎo)致體細(xì)胞核移植效率低的主要原因之一。DNMT1在維持基因組甲基化的過程中發(fā)揮著重要的作用，其對(duì)克隆胚胎發(fā)育相關(guān)基因的正常表達(dá)十分重要。
　　本研究使用不同濃度的5-氮雜-2'-脫氧胞苷處理胎牛成纖維細(xì)胞，并設(shè)計(jì)三條不同的DNMT1特異性siRNA片段轉(zhuǎn)染胎牛

2、成纖維細(xì)胞，研究不同處理對(duì)胎牛成纖維細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞活力、周期、凋亡的影響，并檢測DNMT1基因在胎牛成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平，從而獲得不同處理對(duì)胎牛成纖維細(xì)的影響，為DNMT1的研究以及核移植供體細(xì)胞的選擇提供參考。主要研究結(jié)果如下:
　　1.不同濃度5-氮雜-2'-脫氧胞苷對(duì)胎牛成纖維細(xì)胞的增殖活力、周期、凋亡以及DNMT1表達(dá)水平的影響。
　　選用0、0.01、0.1、0.5、1μmol/L的5-aza-CdR處理胎

3、牛成纖維細(xì)胞。結(jié)果顯示:經(jīng)96h連續(xù)測定發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖速度和細(xì)胞活力隨處理時(shí)間的延長而下降，且隨著5-aza-CdR濃度的增高，其對(duì)胎牛成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用越顯著，細(xì)胞活力下降越快;24-96h，較高濃度（0.5、1μmol/L）的5-aza-CdR對(duì)胎牛成纖維細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用(p＜0.05)，且在48-72h細(xì)胞活力顯著下降(p＜0.05)。24-72h，0.5、1μmol/L的5-aza-C

4、dR對(duì)胎牛成纖維細(xì)胞的G0/G1期具有顯著的抑制作用(p＜0.05);除了0.01μmol/L的5-aza-CdR對(duì)胎牛成纖維細(xì)胞的凋亡影響不顯著以外，其余各組與對(duì)照組相比均對(duì)胎牛成纖維細(xì)胞的凋亡有顯著影響(p＜0.05)。48h，經(jīng)0.5、1μmol/L的5-aza-CdR處理后，胎牛成纖維細(xì)胞中DNMT1的表達(dá)水平分別下降了14％和24％。綜上所述，較高濃度的5-aza-CdR雖然可以下調(diào)DNMT1的表達(dá)水平，但是卻對(duì)細(xì)胞的生長不利

5、，只有低于0.1μmol/L的5-aza-CdR適宜用作處理胎牛成纖維細(xì)胞。
　　2.不同DNMT1特異性siRNA片段對(duì)胎牛成纖維細(xì)胞的增殖活力、周期、凋亡以及DNMT1表達(dá)水平的影響。
　　設(shè)計(jì)三條不同的DNMT1特異性siRNA片段轉(zhuǎn)染胎牛成纖維細(xì)胞。結(jié)果顯示:DNMT1-siRNA3對(duì)DNMT1基因表達(dá)的抑制效果最好，在24h、48h、72h均與對(duì)照組有極顯著差異(p＜0.01)，且在48h時(shí)，DNMT1-siRNA