核心順式元件HDZIP2ATATHB2依賴的海島棉表皮原因子1(GbPDF1)在棉花纖維起始過(guò)程中起重要作用.pdf

1、棉花纖維是棉花的主要產(chǎn)品，是世界上最重要的天然纖維。棉花纖維是在開(kāi)花當(dāng)天前后從胚珠外珠被表皮細(xì)胞突起后伸長(zhǎng)而成的具有特殊結(jié)構(gòu)的單細(xì)胞，一直以來(lái)被視為研究細(xì)胞伸長(zhǎng)及次生壁合成的模式材料，同時(shí)在相關(guān)領(lǐng)域也取得了很好的進(jìn)展。但是，就纖維如何從胚珠外珠被表皮原細(xì)胞分化形成具有突起能力的原纖維細(xì)胞、以及原纖維細(xì)胞如何向外突起形成具有快速伸長(zhǎng)能力的纖維細(xì)胞這兩個(gè)問(wèn)題進(jìn)行的研究雖在增多，但所取得的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論支持還不夠充足。由于成熟棉花纖維的產(chǎn)量及

2、品質(zhì)在一定程度上依賴于胚珠表皮細(xì)胞分化形成纖維細(xì)胞的數(shù)目以及纖維起始的時(shí)間早晚，對(duì)這一發(fā)育過(guò)程中進(jìn)行分子生物學(xué)研究就顯得非常必要，不僅可以豐富現(xiàn)有理論，在實(shí)踐中為利用基因工程改良棉花纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)提供一條有效途徑。
　　 本研究以海島棉來(lái)源的GbPDFI為出發(fā)點(diǎn)，對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式以及在棉花纖維起始過(guò)程中的功能和作用機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和探討，在分離了與之相互作用的蛋白分子之外，還對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了的研究。其主要結(jié)果如

3、下：
　　 1.海島棉與陸地棉中PDF1基因的結(jié)構(gòu)及氨基酸序列分析
　　 根據(jù)海島棉花纖維發(fā)育平衡化cDNA中的GbPDF1序列信息，分別從海島棉3-79和陸地棉TM-1的基因組中擴(kuò)增得到3條和2條PD目的DNA片段；根據(jù)這五條序列內(nèi)含子的數(shù)目將其分為3類(lèi)：TypeⅠ(無(wú)內(nèi)含子)，有1個(gè)(TypeⅡ)或2個(gè)內(nèi)含子(TypeⅢ)；編碼氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示TypeⅠ與TypeⅡ所包含的三條序列幾乎一致，但TypeⅢ的兩條序

4、列則具有更多“SYGGGSPP”重復(fù)單元；不同物種間PDF1蛋白在羧基端保守性較強(qiáng)。
　　 2.抑制棉花中PD目的表達(dá)推遲了纖維的分化
　　 通過(guò)RNAi的方法，獲得了PDF1受抑制的轉(zhuǎn)基因棉花植株，通過(guò)掃描電鏡分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因材料胚珠表面的纖維突起進(jìn)程比野生型緩慢，具體表現(xiàn)為：開(kāi)花前12小時(shí)左右野生型已有明顯可見(jiàn)突起的纖維細(xì)胞，而PDF1被干涉植株胚珠表面未見(jiàn)有纖維突起；l DPA的野生型胚珠表面纖維已開(kāi)始伸長(zhǎng)，但同一時(shí)

5、期干涉株系胚珠上才可見(jiàn)到剛突起纖維細(xì)胞；PDF1表達(dá)被抑制株系成熟纖維衣分下降，長(zhǎng)度變短。
　　 3.PDF1調(diào)控纖維發(fā)育的可能機(jī)制
　　 PDF1表達(dá)被抑制的轉(zhuǎn)基因棉花胚珠中H202含量比野生型有明顯的增加，但通過(guò)間接分析發(fā)現(xiàn)乙烯的含量沒(méi)有受到促進(jìn)，反倒有可能出現(xiàn)下降；同時(shí)由于編碼碳源轉(zhuǎn)運(yùn)及某種特殊結(jié)構(gòu)果膠多糖合成關(guān)鍵酶類(lèi)基因表達(dá)豐度的下降，可能降低了果膠質(zhì)合成的效率，最終導(dǎo)致纖維發(fā)育受阻。
　　 4.與GbP

6、DF1相互作用蛋白質(zhì)的分離
　　 通過(guò)酵母雙雜交的方式以GAL4-DBD：：GbPDF1融合蛋白為誘餌進(jìn)行篩庫(kù)獲得了13個(gè)可能與之相互作用的蛋白，重新轉(zhuǎn)化及雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了三個(gè)蛋白(PPIP1，PPIP2和PPIP3)可與其發(fā)生相互作用。這三個(gè)蛋白均具有保守結(jié)構(gòu)域，可能分別參與蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解、細(xì)胞內(nèi)特定膜相關(guān)蛋白的運(yùn)送及H2O2含量的調(diào)控、磷脂蛋白信號(hào)傳導(dǎo)等生理生化過(guò)程。
　　 5.煙草中超量表達(dá)GbPD

7、F1促進(jìn)其初生根增長(zhǎng)
　　 獲得了組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GbPDF1在煙草中表達(dá)的T2代純系，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這些轉(zhuǎn)基因煙草從萌發(fā)后1天開(kāi)始其初生根就比野生型要長(zhǎng)。
　　 6.GbPDF1啟動(dòng)子的分離及表達(dá)模式分析
　　 通過(guò)Genome-Walking的方法獲得了GbPDF1基因的兩條啟動(dòng)子序列，分別命名為PGbPDF1-1(1679bp)及PGbPDF1-2(1285bp)；這兩條序列從翻譯起始位點(diǎn)ATG開(kāi)始至

8、其上游390bp處的片段DNA組成幾乎一致；分別將PGbPDF1-1和PGbPDF1-1與GUS融合獲得轉(zhuǎn)基因棉花植株，通過(guò)報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)啟動(dòng)子的具有一致的表達(dá)模式：在開(kāi)花當(dāng)天的胚珠中表達(dá)豐度最高，而3～15 DPA的胚珠及纖維中GUS蛋白活性逐漸降低。
　　 7.GbPDF1轉(zhuǎn)錄所必需啟動(dòng)予序列及核心順式元件的確定
　　 通過(guò)啟動(dòng)子5’端的逐漸缺失發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)度為236bp的啟動(dòng)子足夠驅(qū)動(dòng)下游基因在胚珠及纖維中的表達(dá)

9、，-128～-236bp對(duì)GbPDF1基因的轉(zhuǎn)錄是必須的；對(duì)該區(qū)域可能起作用的幾個(gè)順式元件分別突變后轉(zhuǎn)化擬南芥，發(fā)現(xiàn)一個(gè)長(zhǎng)度為9bp的名為HDZIP2ATATHB2的調(diào)控序列對(duì)該啟動(dòng)子正常工作是必不可少的，凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明擬南芥生殖器官及海島棉開(kāi)花后5天纖維中的核提取物可與該元件在體外相互結(jié)合。
　　 根據(jù)上述研究所得結(jié)論，可以認(rèn)為PDF1在棉花纖維的起始過(guò)程中行使重要的功能。PDF1在纖維起始過(guò)程中可能通過(guò)調(diào)控胚珠表皮原細(xì)