耐鹽基因StP5CS轉(zhuǎn)化結(jié)球甘藍的研究.pdf

1、結(jié)球甘藍是十字花科（Cruciferase）蕓薹屬（Brassica）植物，是我國重要的葉菜類蔬菜之一。土壤鹽漬化嚴重影響著我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境，我國還有大面積的鹽堿地，培育耐鹽結(jié)球甘藍品種成為一個日益緊迫而意義重大的研究課題。本研究以幾個結(jié)球甘藍高代純合系為試驗材料，建立并優(yōu)化結(jié)球甘藍再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過農(nóng)桿菌介導法和floral-dip轉(zhuǎn)化法兩種方法，將耐鹽基因StP5CS導入結(jié)球甘藍中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。采用PCR、Sout

2、hern blot和RT-PCR等技術(shù)對轉(zhuǎn)基因植株進行鑒定，并對其進行了鹽脅迫處理。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.以結(jié)球甘藍G1、G2和G3的具柄子葉和下胚軸為外植體，研究了苗齡、不同激素濃度配比、添加不同濃度AgNO3對外植體不定芽誘導率的影響，建立并優(yōu)化了結(jié)球甘藍再生體系:5d苗齡的外植體再生頻率最高;G1是較好的基因型，其下胚軸接種于MS+1.0 mg/L6-BA+0.05mg/L NAA時不定芽的再生頻率最高，為76.5

3、1％，具柄子葉接種于MS+4.0 mg/L6-BA+0.05mg/L NAA時不定芽的再生頻率較高，為73.63％;在培養(yǎng)基中添加銀離子可以減輕結(jié)球甘藍外植體的褐化，促進不定芽的再生，AgNO3的濃度為7.5 mg/L時再生頻率最高，為80.86％。
　　 2.以G1的具柄子葉和下胚軸為受體，采用農(nóng)桿菌介導法進行耐鹽基因StP5CS的遺傳轉(zhuǎn)化，對雙丙氨膦選擇壓、侵染時間、預培養(yǎng)時間、共培養(yǎng)時間、乙酰丁香酮(AS)濃度等因素進行研

4、究，建立并優(yōu)化了遺傳轉(zhuǎn)化體系:4mg/L、8mg/L的雙丙氨膦濃度分別可以有效的篩選出下胚軸及具柄子葉的轉(zhuǎn)基因植株;G1下胚軸預培養(yǎng)2d，經(jīng)OD600≈0.5農(nóng)桿菌侵染5 min后，接種于添加0.1 mmol/L AS的PM1培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2d，轉(zhuǎn)入SM2培養(yǎng)基中篩選，轉(zhuǎn)化率最高達24.47％。
　　 3.采用優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化體系，對G1進行轉(zhuǎn)化，共獲得了86株抗性苗。利用PCR擴增、southern blot及RT-PCR

5、檢測外源基因StP5CS的整合與表達，結(jié)果表明，有23株抗性苗PCR、 southern blot及RT-PCR檢測均呈陽性，擴增到639bp的條帶，與StP5CS基因完全一致，證實StP5CS基因已經(jīng)整合進入G1基因組中，并得到了表達。用未轉(zhuǎn)化的結(jié)球甘藍植株及轉(zhuǎn)基因植株進行梯度鹽脅迫試驗，通過測定SOD、脯氨酸的含量及相對膜透性表明轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性明顯提高。
　　 4.采用floral-dip法轉(zhuǎn)化結(jié)球甘藍G1、G2和G4，通

6、過對影響該轉(zhuǎn)化法的幾個關(guān)鍵因素（表面活性劑silwet L-77的濃度、轉(zhuǎn)化液中蔗糖的濃度、植物生長狀態(tài)）的研究，建立了較優(yōu)的floral-dip轉(zhuǎn)化法體系，結(jié)果表明:silwet L-77的濃度為0.05％、蔗糖的濃度為10％，花序上花蕾的長度＜8 mm的條件下，噴施除草劑Basta后成活率最高，為6.87％。通過對抗性植株進行PCR、Southern blot和RT-PCR檢測，確定目的基因已經(jīng)整合到結(jié)球甘藍的基因組中并得到有效的表