轉(zhuǎn)棉蚜羧酸酯酶基因果蠅品系的構(gòu)建與抗性研究.pdf

1、殺蟲劑的廣泛使用，迫使昆蟲產(chǎn)生抗藥性以適應(yīng)環(huán)境的變化和各種選擇壓。有機(jī)磷類、有機(jī)氯類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類等化學(xué)殺蟲劑是人們最常使用的?？顾幮援a(chǎn)生的分子機(jī)制主要包括代謝抗藥性和靶標(biāo)抗藥性，代謝抗藥性主要是指抗藥性蛋白的表達(dá)水平或活性的變化，如非特異性羧酸酯酶的過量表達(dá)和活性增強(qiáng)，及P450單加氧酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的擴(kuò)增等。靶標(biāo)抗藥性主要是指殺蟲劑的靶標(biāo)蛋白敏感性的變化，如鈉離子通道、乙酰膽堿酯酶及γ-氨基丁酸受體的突變等。昆蟲羧

2、酸酯酶通過降解有機(jī)磷類殺蟲劑而產(chǎn)生的抗藥性機(jī)制有兩種，一種是通過基因擴(kuò)增或轉(zhuǎn)錄調(diào)控導(dǎo)致蛋白的過量表達(dá)，另一種是編碼酯酶的基因序列發(fā)生突變，使酶的性質(zhì)改變而獲得有機(jī)磷水解酶活性。
　　本論文應(yīng)用轉(zhuǎn)基因果蠅技術(shù)，采用經(jīng)典的Ga14/UAS系統(tǒng)，成功構(gòu)建了3種轉(zhuǎn)棉蚜羧酸酯酶基因果蠅品系：轉(zhuǎn)野生型基因(Est-wild)純合果蠅品系、轉(zhuǎn)A151D位點突變型基因(Est-A151D)純合果蠅品系、轉(zhuǎn)W271L位點突變型基因(Est-W271

3、L)純合果蠅品系。轉(zhuǎn)基因果蠅品系與Ga14果蠅品系雜交，啟動了棉蚜羧酸酯酶基因在果蠅體內(nèi)的表達(dá)。對轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行分子生物學(xué)驗證，熒光定量PCR結(jié)果顯示，3種外源的羧酸酯酶基因轉(zhuǎn)入果蠅基因組的拷貝數(shù)都是單拷貝，在轉(zhuǎn)錄組水平上，3種羧酸酯酶基因在果蠅體內(nèi)也沒有顯著性差異。對轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行羧酸酯酶活性的檢測，淀粉凝膠電泳圖定性的顯示出野生型羧酸酯酶活性明顯高于兩突變型，酶活性定量測定結(jié)果顯示野生型羧酸酯酶活性為突變型的2-3倍。分子生物學(xué)和酶

4、活測定結(jié)果說明在果蠅體內(nèi)棉蚜羧酸酯酶發(fā)生突變后會失去原有的酯酶活性。通過對轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行生物學(xué)測定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)A151D和W271L突變型棉蚜羧酸酯酶基因果蠅對毒蟲畏的抗藥性明顯高于轉(zhuǎn)野生型基因果蠅，而對馬拉硫磷、對硫磷、久效磷和溴氰菊酯都沒有提高抗藥性，說明羧酸酯酶基因突變可以使其獲得更高的對毒蟲畏的有機(jī)磷水解酶活性，而其原有的酯酶活性喪失。相對W1118×Ga14對照組果蠅，3種轉(zhuǎn)棉蚜羧酸酯酶基因果蠅對馬拉硫磷、對硫磷、溴氰菊酯抗藥性均