Ⅱ型豬圓環(huán)病毒ORF3蛋白的抗原表位及核輸出信號分析.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，是一種單鏈、環(huán)狀的DNA病毒，包含致病性的Ⅱ型豬圓環(huán)病毒(PCV2)和無致病性的Ⅰ型豬圓環(huán)病毒(PCV1)。PCV2引發(fā)的斷奶仔豬多系統(tǒng)綜合征目前已經(jīng)成為養(yǎng)豬業(yè)中非常普遍的一種傳染性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失。到目前為止，已經(jīng)證明PCV至少含有ORF1、ORF2、ORF3和ORF4四個編碼閱讀框編碼病毒蛋白。ORF3蛋白被認為與致病性和細胞凋亡

2、相關(guān)。本研究嘗試分析其抗原表位與細胞生物學(xué)特性。
　　以抽提的PCV2基因組DNA為模板，利用PCR法擴增PCV2的ORF3全長基因，然后克隆到pET-28a(+)原核表達載體上。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株，IPTG誘導(dǎo)表達，ORF3能以包涵體形式被表達，表達的融合蛋白采用Ni-NTA鎳柱可純化出較高純度的His-ORF3蛋白。以純化的His-ORF3蛋白作為免疫原免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾臟

3、與小鼠骨髓瘤細胞進行融合。經(jīng)過HAT和HT選擇培養(yǎng)基、ELISA和間接免疫熒光抗體實驗篩選后，獲得3株能穩(wěn)定分泌ORF3抗體的細胞株3C3、4D5、5F17。結(jié)果顯示，三株單抗均能識別PCV2感染細胞內(nèi)的ORF3蛋白，而與ORF3缺失的PCV2感染細胞沒有反應(yīng)。
　　采用合成ORF3線性多肽和構(gòu)建ORF3截短體轉(zhuǎn)染細胞進行單克隆抗體的識別表位鑒定，結(jié)果顯示，ORF3特異性線性表位83GTHSSRQVTPLSL95能被單克隆抗體3B

4、1、1H3、3D12識別，不被單克隆抗體3C3、4D5、5F17識別。單克隆抗體3C3、4D5、5F17不識別ORF3的線性表位。
　　利用單克隆抗體3C3觀察不同感染時間下分析ORF3蛋白的亞細胞定位變化，結(jié)果顯示，ORF3蛋白在胞漿內(nèi)合成后被運輸?shù)郊毎?。利用?gòu)建的pEGFP-ORF3截短體和pEGFP-GST-ORF3截短體轉(zhuǎn)染細胞觀察ORF3蛋白的定位，否定了之前預(yù)測ORF3蛋白存在2個核定位信號序列53FQKFSQPAE