家蠶、野桑蠶LSP與HSC70-4基因啟動子功能特性分析.pdf

1、從家蠶、野桑蠶基因組DNA克隆了LSP和HSC70-4基因啟動子調(diào)控區(qū),以luc為報告基因,構(gòu)建了系列報告質(zhì)粒,經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞或蠶體內(nèi)瞬時表達(dá),對BmLSP和Bm/BmandHSC70-4基因啟動子的功能特性進(jìn)行了分析研究,為進(jìn)一步闡明LSP、HSC70-4基因的表達(dá)調(diào)控分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ),同時為HSC70-4基因啟動子實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行了探索研究.該論文的主要研究內(nèi)容如下:一、Bm/BmandLSP5'FR克隆與BmLSP啟動子功能特

2、性分析克隆的Bm和BmandLSP5'FR片段經(jīng)測序分析,涵蓋了LSP的第一內(nèi)含子,第一外顯子、核心啟動子區(qū)及其5'上游區(qū)四部分;在啟動子區(qū)域內(nèi)有經(jīng)典的TATA盒,脂肪體內(nèi)組織特異性表達(dá)基因的共有序列和推定的激素響應(yīng)元件,5'上游區(qū)發(fā)現(xiàn)了與家蠶絲素輕鏈基因第一內(nèi)含子區(qū)域的高度同源序列和失活的部分水手轉(zhuǎn)座子元件(MLE).采用PCR法和限制性內(nèi)切酶法獲得了系列缺失BmLSP基因啟動子,在BmN細(xì)胞瞬時表達(dá)系統(tǒng)考察了第一內(nèi)含子(Ⅰ)、含絲素

3、輕鏈基因第一內(nèi)含子區(qū)域同源序列(S)以及MLE對BmLSP基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性的影響,結(jié)果表明Ⅰ能顯著增加啟動子的轉(zhuǎn)錄活性達(dá)5.4-5.8倍,S增加啟動子轉(zhuǎn)錄活性4.42倍,暗示在Ⅰ、S中可能存在類似增強(qiáng)子的元件.而MLE則抑制啟動子的轉(zhuǎn)錄活性.昆蟲激素JHA對BmLSP啟動子轉(zhuǎn)錄活性影響呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng),1 μg/ml處理增加2.97倍,2-6 μg/ml處理不影響,8 μ g/ml處理顯著降低轉(zhuǎn)錄活性2.85倍;而MH處理對其活性沒

4、有顯著影響.二、Bm/Bmand HSC70-45'FR克隆及啟動子功能特性分析克隆的BmandHSC70-4、BmHSC70-45'FR經(jīng)測序分析涵蓋了部分第一外顯子和啟動子區(qū);推測了可能存在的順式作用元什有6個GATA盒、2個CAAT盒和2個熱激響應(yīng)因子(HSF)結(jié)合元件,但沒有發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的TATA盒與GC盒.在常態(tài)下BmHSC70-4啟動子、BmandHSC70-4啟動子在BmN細(xì)胞、sf21細(xì)胞和五齡蠶體內(nèi)都呈現(xiàn)高轉(zhuǎn)錄活性;37℃

5、熱激處理BmN、Sf21細(xì)胞和四齡蠶體能增加啟動子的轉(zhuǎn)錄活性,且在sf21細(xì)胞中熱激效果更為明顯,而在五齡家蠶體內(nèi)熱激處理卻抑制其轉(zhuǎn)錄活性;在五齡家蠶體內(nèi),JHA不影響B(tài)mHSC70-4啟動子轉(zhuǎn)錄活性,低劑量MH處理顯著提高轉(zhuǎn)錄活性,而高劑量(5 μ g MH/頭)處理沒有顯著影響;在家蠶五齡蠶體內(nèi)不同發(fā)育階段BmHSC70-4啟動子的轉(zhuǎn)錄活性有所波動,到熟蠶期達(dá)到最高.以上結(jié)果表明Bm、BmandHSC70-4啟動子既具有組成型特征,

6、又有一定的誘導(dǎo)型特征.三、BmNPVhr3對Bm/Bmand HSC70-4啟動子活性的增強(qiáng)功能hr3是來源于BmNPV同源序列,具有BmNPV復(fù)制起始位點(diǎn)和增強(qiáng)子的雙重功能.結(jié)果表明hr3能增強(qiáng)Bm/Bmand HSC70-4啟動子活性,在BmN細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)16-18倍,且與hr3接入方向無關(guān);在蠶體內(nèi)分別增強(qiáng)190.57倍,242.19倍;在五齡家蠶體內(nèi),JHA不影響B(tài)mHSC70-4/hr3組合轉(zhuǎn)錄活性,不同劑量MH處理顯著提高轉(zhuǎn)錄