殼聚糖對轉(zhuǎn)染人骨形成蛋白2基因的NIH3T3細(xì)胞相容性研究.pdf

1、牙周病是人類最常見的口腔疾病之一，也是導(dǎo)致成人失牙的最主要的原因。牙周治療理想的目標(biāo)就在于誘導(dǎo)牙周組織再生，重建新生的牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)，恢復(fù)牙周組織的結(jié)構(gòu)和功能。目前牙周病的治療尚不能從根本上實現(xiàn)這一目標(biāo)。組織工程是一個以細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和生物材料學(xué)為基礎(chǔ)，采用發(fā)育的方法，以新組織替代損傷組織的新興科學(xué)領(lǐng)域。隨著組織工程向牙周相關(guān)領(lǐng)域滲透，給牙周病的治療開辟了新的思路。 組織工程的三大要素是：具有增殖分化潛能的種子細(xì)

2、胞、細(xì)胞外基質(zhì)材料、生長因子的作用。如何將種子細(xì)胞復(fù)合生長因子后植入細(xì)胞外基質(zhì)材料，實現(xiàn)三者有效地統(tǒng)一，發(fā)揮功能是當(dāng)前研究較多的內(nèi)容。骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)是最常用的應(yīng)用于誘導(dǎo)牙周組織再生的生長因子。如采用基因工程的方法，將BMP基因?qū)敕N子細(xì)胞，置于細(xì)胞外基質(zhì)替代材料(即支架)后植入牙周骨缺損部位，使之在局部分泌BMP生長因子，可有效地實現(xiàn)牙周組織再生的目標(biāo)。 支架材料是種子

3、細(xì)胞的生長土壤，現(xiàn)在組織工程學(xué)者關(guān)注的是天然支架的開發(fā)。殼聚糖是從甲殼類動物外殼中提取出來的直鏈純天然多糖，也是自然界唯一具有弱陽離子型電解質(zhì)的新型生物醫(yī)用材料。殼聚糖結(jié)構(gòu)中含有與細(xì)胞外基質(zhì)主要成分糖胺多糖(Glycosaminoglycan，GAG)共有的N-乙酰葡聚胺組分。殼聚糖容易被溶菌酶降解，具有廣譜抗菌性，其良好的塑形性及可加工性，可被加工成任意形狀。殼聚糖有良好的成膜性，成膜后具有很好的均一性和較高的機(jī)械強(qiáng)度，具有成為一種支

4、架的可能性。但將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與殼聚糖等生物材料復(fù)合，國內(nèi)外研究甚少。本實驗將轉(zhuǎn)染hBMP2基因的NIH3T3細(xì)胞接種殼聚糖膜支架，采用細(xì)胞生長增殖實驗、成骨活性測定等檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與殼聚糖的生物相容性，初步探察其在牙周組織工程的意義。 第一部分 殼聚糖膜的制備及性能檢測 目的：制備適合細(xì)胞培養(yǎng)的殼聚糖膜，并檢測其吸水率與體外降解率。 方法：將殼聚糖粉溶于1.5％乙酸，制成2％的濃度，采用流延法傾注于圓形蓋玻片上，直

5、徑與24孔培養(yǎng)板孔徑一致，烘干后成膜。測試2％殼聚糖膜的吸水率與體外降解率。 結(jié)果：殼聚糖膜表面平整，與蓋玻片附著緊密，無卷邊現(xiàn)象。2％殼聚糖膜的吸水率均值為106.5％，殼聚糖膜的降解速度明顯慢于實驗組，60d重量僅喪失了17.8％。在含溶菌酶的降解液中降解速度較快：10d時，重量喪失達(dá)8.8％；30d時，重量喪失達(dá)30％左右；40d時，重量喪失約一半左右；60d時已基本降解完全。 結(jié)論：殼聚糖具有良好的成膜性和潤濕性

6、。在溶菌酶中，殼聚糖膜具有較快的降解速度。 第二部分 殼聚糖膜對轉(zhuǎn)染hBMP 2基因的NIH3T3細(xì)胞增殖活性的影響 目的：探討轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在殼聚糖膜上粘附、生長和增殖情況。 方法：首先作轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的生長曲線，然后將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞消化后，種植于殼聚糖膜表面，以蓋玻片為對照，6h后檢測初始粘附率，2、4、6d時在倒置光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡下，觀察細(xì)胞的粘附和生長情況，用MTT增殖實驗檢測增殖情況。 結(jié)果：NIH3T

7、3細(xì)胞在轉(zhuǎn)入基因后，增殖能力略有降低。6h初始粘附率實驗組高于對照組。殼聚糖膜能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在其表面的粘附和形態(tài)保持，增殖指數(shù)增高(P<0.05)。 結(jié)論：殼聚糖膜支持轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的粘附、生長和增殖。 第三部分 殼聚糖膜對轉(zhuǎn)染hBMP2基因的NIH3T3細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響 目的：觀察殼聚糖膜對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞成骨分化能力的影響。 方法：將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞消化后，種植于殼聚糖膜表面，以蓋玻片為對照組，2、4、6