MiR-133a抗阿霉素誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的：構(gòu)建miR—133a的真核表達(dá)載體，研究miR—133a在阿霉素誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡中的作用，為心血管疾病的靶向治療研究提供理論依據(jù)。
　　 方法：(1)設(shè)計(jì)并合成DNA模板引物，用T4 DNA連接酶將pre—mir—133a連接到線性化的Pgenesil—1．1質(zhì)粒中，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定。(2)以Lipofectamine TM2000 Reagent將鑒定正確的重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒、mo—mir—133a in

2、hibitor以及MicroRNA inhibitor N．C瞬時(shí)轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀及倒置熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。(3)轉(zhuǎn)染后72h加入阿霉素?fù)p傷細(xì)胞，加藥后分為4組：空質(zhì)粒對(duì)照組，重組質(zhì)粒組，Inhibitor組，Inhibitor N．C組。(4)qRT—PCR檢測(cè)各組細(xì)胞Caspase—9及PDCD4在mRNA水平的變化。(5)Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Caspase—9及PDCD4蛋白水平的表達(dá)。
　

3、　 結(jié)果：(1)成功構(gòu)建了miR—133a真核表達(dá)載體。(2)用重組質(zhì)粒Pgenesil—1．1—pre—mir—133a瞬時(shí)轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)70％以上。(3)qRT—PCR結(jié)果示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒及Inhibitor后，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對(duì)照組相比，細(xì)胞中Caspase．9及PDCD4基因的mRNA表達(dá)水平均沒(méi)有明顯變化(P>0．05)。(4)Western blot結(jié)果示轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞中，Caspase—9及PDCD4蛋白有

4、低表達(dá)；轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，上調(diào)miR—133a的表達(dá)，Caspase—9及PDCD4蛋白的表達(dá)水平降低(0．409±0．009 vs0．245±0．007，P<0．05;0．395±0．008 vs0．236±0．019，P<0．05)；轉(zhuǎn)染Inhibitor抑制了miR—133a的表達(dá)，Caspase—9及PDCD4蛋白表達(dá)水平顯著升高(0．409±0．009 vs0．675±0．018，P<0．05;0．395±0．008 vs0．6