水稻白葉枯病抗性基因Xa22(t)的克隆.pdf

1、由Xanthomonas oryzae pv.oryzae引起的白葉枯病嚴重危害水稻,可是國內一直集中利用Xa3和Xa4兩個抗性基因,因而利用新的抗性基因改良現(xiàn)有品種的抗性日趨重要.云南地方粳稻扎昌龍(Zhachanglong,ZCL)對分別來自中國、菲律賓和日本的12個水稻白葉枯病菌表現(xiàn)抗性,對PXO61表現(xiàn)出的成株期抗性受Xa22(t)控制.已從明恢63中克隆的Xa26與Xa3可能是相同的基因,ZCL中含有Xa26相同的基因.(1)

2、目標基因Xa22(t)的精細定位.構建了7680個單株的由珍珠矮和扎昌龍配制的F<,2>群體,用兩個SSR標記RM144和RM224篩選PXO61接種后的極端感病單株得到29個極端感病重組單株,目標基因Xa22(t)與RM144和RM224分別有20個和9個極端感病重組.利用這些重組單株分析Xa22(t)區(qū)域的標記,將Xa22(t)定位在明恢63-BAC克隆M3H8的亞克隆3/7A10和R1506之間,和這兩個標記分別有2個和1個重組,

3、同時得到三個共分離的標記M3H8-1、Sub11和X4-88.由于3/7A10是M3H8的亞克隆,并且R1506能和M3H8雜交,因而Xa22(t)定位在M3H8上.利用Xa26的序列檢索得到日本晴序列克隆AC116367,分析這個克隆發(fā)現(xiàn)抗病基因有關的序列信息很豐富,而且AC116367在目標基因Xa22(t)區(qū)域,因而將AC116367作為目標基因Xa22(t)的電子定位克隆.(3)確定候選基因及驗證功能.對M3H8的兩個片段的序列

4、進行酶切位點分析,SpeI可以將包含Xa26的19-kb片段切下來,NheI可以將8-kb的LRR片段切下來,AccI酶切片段可以覆蓋12-kb的LRR-Kinase.于是根據(jù)M3H8的序列,采用等位酶切法加收ZCL對應大小的片段區(qū)域,克隆到合適載體上用特異引物篩選,再將得到的陽性克隆的外源片段轉接到pCAMBIA1301,最后轉化到感病品種臺北309中來驗證功能.(3)Xa22(t)區(qū)域相關片段的RT-PCR表達分析.對于Xa26內的

5、兩對引物RkbL-2R和Rkb469-2145,在三個抗病材料ZCL(Xa22(t))、Wase Aikoku 3(WA3,攜帶Xa3)和IRBB4(Xa4)中組成型表達,而在ZZA中沒有表達,這可能與Xa26表現(xiàn)的抗病功能有關.利用一個激酶結構RKORF1內的幾對引物作RT-PCR表達分析,RKORF1在ZCL、WA3和IRBB4中組成型表達,在ZCL和WA3中的表達相同,而在ZCL與IRBB4中的表達有差異,Xa22(t)區(qū)域可能具