問號鉤端螺旋體賴型IPAV株全基因組測序.pdf

1、第一部分 問號鉤端螺旋體賴型IPAV 株全基因組測序 鉤端螺旋體(Leptospira，簡稱鉤體)是具有獨特形態(tài)結(jié)構(gòu)、特殊進化地位的一類革蘭陰性菌。致病性鉤體可引起鉤體病，具有重要的醫(yī)學(xué)意義。 2003 年，我們研究組完成了致病性問號鉤體賴型＃56601 株全基因組測序。經(jīng)幾年的功能基因組研究，目前還尚未找到其致病的關(guān)鍵因素。 在這種背景下，我們決定對無致病性的問號鉤體賴型IPAV 株進行全基因組測序，并通過基因

2、組的比較分析來揭示＃56601 株致病的分子基礎(chǔ)。 本課題采用最新的pyrosequencing 測序法和傳統(tǒng)的雙脫氧末端終止法(Sanger 法)相結(jié)合的策略，對問號鉤體賴型IPAV 株進行全基因組測序。整個測序過程分為三個階段。首先，以Genome Sequencer 20 System(GS20，454 Life Sciences )進行大規(guī)模測序。共得到872719 條高質(zhì)量的序列讀長(reads)，達基因組17 倍覆蓋

3、率(coverage)，經(jīng)軟件直接拼裝(denovo assembly)，生成了996 個序列重疊群(contig)。第二步，我們選取長度大于600 bp 的contig 與＃56601 株全基因組序列做blastn 比對，以排定contig 彼此間的位置關(guān)系。在此基礎(chǔ)上采用PCR 及測序的方法進行缺口填補工作，最終形成兩個環(huán)狀染色體： Chromosome I 和Chromosome II。第三步，通過糾正由重復(fù)序列導(dǎo)致的錯誤組裝以及

4、對低質(zhì)量區(qū)域(weak region)的重新測序，使兩條染色體序列的錯誤率降至0.05/10kb，符合國際認可的精確測序標(biāo)準(錯誤率低于1/10kb)。 測序完成后，對問號鉤體IPAV 株與＃56601 株全基因組進行了初步結(jié)構(gòu)差異的比較。發(fā)現(xiàn)了IPAV 株較＃56601 株多出了長達14 kb 的DNA片段，此片段包含一個轉(zhuǎn)座酶基因及其它一些功能基因。另外，在IPAV株上，還出現(xiàn)了一條約6.5 kb 的區(qū)域發(fā)生倒置的情況。其它

5、一些結(jié)構(gòu)的差異較小，大多在2 kb 以下。此外，我們還對＃56601 株中兩個曾經(jīng)遺漏的區(qū)域進行了校正。 本課題獲得了問號鉤體全基因組序列，為接下來的功能注釋及分析致病株與非致病株鉤體間的差異打下了基礎(chǔ)。 第二部分 雙曲鉤端螺旋體溶血素基因tlyA 的克隆、表達及初步功能鑒定 為了研究非致病性雙曲鉤端螺旋體(Leptospira biflexa，簡稱雙曲鉤體)是否含有溶血素基因，并鑒定其溶血活性。我們對雙曲鉤體L

6、EBIa2503 基因編碼產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)域預(yù)測、序列比對后，PCR 擴增目的片段、克隆到原核表達載體pET28b(+)，轉(zhuǎn)化宿主細胞，并誘導(dǎo)表達產(chǎn)物進行初步功能鑒定。同時，以RT-PCR 檢測LEBIa2503 的轉(zhuǎn)錄情況。 另外，也對雙曲鉤體菌體本身有無溶血活性進行檢測。 我們發(fā)現(xiàn)雙曲鉤體LEBIa2503 基因與問號鉤體tlyA 溶血素基因在蛋白水平上有相同的結(jié)構(gòu)域，屬于直系同源基因(orthologues gene)