小薊飲子及其配伍對關(guān)木通腎毒性的減毒作用及機(jī)理研究.pdf

1、目的：通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，研究小薊飲子及其配伍對關(guān)木通腎毒性的減毒配伍途徑及可能的減毒機(jī)理。 方法：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將大鼠隨機(jī)分為7個(gè)組，分別給予生理鹽水、關(guān)木通水煎液、小薊飲子水煎液、關(guān)木通與小薊飲子中君、臣、佐、使不同配伍的水煎液灌胃，3周后，觀察各組大鼠的一般情況，測定相關(guān)腎功能指標(biāo)并對腎組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察。 體外實(shí)驗(yàn)： 1.對關(guān)木通對照組、小薊飲子組、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)可能篩選出的有效減毒配伍組，用高效液相色譜法測定各組中馬兜

2、鈴酸Ⅰ(AAⅠ)的含量。根據(jù)關(guān)木通對照組中從Ⅰ的濃度，分別配制與之濃度相一致的各組實(shí)驗(yàn)藥液。 2.應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，進(jìn)行人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)的培養(yǎng)。 3.建立不同濃度關(guān)木通(按其中所含AAⅠ計(jì)算)所導(dǎo)致的HK-2細(xì)胞凋亡模型，并確定一理想濃度進(jìn)行減毒機(jī)理研究。 4.各組藥液分別加入體外培養(yǎng)好的HK-2細(xì)胞中。每隔4小時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)改變，24小時(shí)后于倒置顯微鏡下觀察并照相。 5.分組處理24

3、小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測，分析凋亡細(xì)胞比例。 6.分組處理24小時(shí)后，用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清液中轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)的表達(dá)情況。 結(jié)果： 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： 1.各組大鼠的一般情況小薊飲子組、關(guān)木通+君藥組、關(guān)木通+臣藥組大鼠的一般情況，比單純關(guān)木通組有明顯改善。 2.大鼠相關(guān)腎功能比較結(jié)果小薊飲子組、關(guān)木通+君藥組、關(guān)木通+臣藥組的血BUN、Scr與關(guān)木通組比較明顯降低(P<0.01)。

4、 3.大鼠腎組織切片在光鏡和電鏡下的觀察結(jié)果分別在光鏡和電鏡下觀察各組大鼠腎組織切片，可見正常對照組的腎小球、腎小管及腎間質(zhì)未見明顯異常，其余各組有不同程度的損傷，但小薊飲子組、關(guān)木通+君藥組、關(guān)木通+臣藥組的損傷程度明顯小于關(guān)木通組、關(guān)木通+佐藥組及關(guān)木通+使藥組。 體外實(shí)驗(yàn)： 1.馬兜鈴酸Ⅰ(AAⅠ)的含量結(jié)果采用高效液相色譜法檢測關(guān)木通組、小薊飲子組、關(guān)木通+君藥組、關(guān)木通+臣藥組的AAⅠ的含量分別為0.6

5、034mg/ml，0.1060 mg/ml，0.1119mg/ml，0.1600mg/ml。 2.HK-2細(xì)胞體外培養(yǎng)結(jié)果經(jīng)傳代培養(yǎng)后的HK-2細(xì)胞，一般24小時(shí)全部貼壁，純度極高，生長迅速，很快融合成片，密集時(shí)可重疊生長，3-5天即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)成功且符合實(shí)驗(yàn)要求。 3.HK-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果在倒置顯微鏡下觀察，正常對照組HK-2細(xì)胞為卵圓形或多邊形貼壁細(xì)胞，細(xì)胞間連接緊密，成片生長。小薊飲子組、關(guān)木通+

6、君藥組、關(guān)木通+臣藥組可見細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞折光度增強(qiáng)，細(xì)胞變小、變圓。關(guān)木通組可見到大多數(shù)細(xì)胞明顯縮小變圓，與周圍細(xì)胞脫離，細(xì)胞膜仍保持完整，但表面有“發(fā)泡”現(xiàn)象，部分細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)液中。 4.HK-2細(xì)胞凋亡比例結(jié)果用流式細(xì)胞儀檢測分析凋亡細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)小薊飲子組、關(guān)木通+君藥組、關(guān)木通+臣藥組的HK-2細(xì)胞凋亡率低于單純的關(guān)木通組(P<0.05)。 5.細(xì)胞上清液中TGFβ1的表達(dá)結(jié)果用ELISA試劑盒檢測TGFβ1

7、的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)小薊飲子組、關(guān)木通+君藥組、關(guān)木通+臣藥組的細(xì)胞上清液中TGFβ的分泌水平低于單純關(guān)木通組(P<0.01)。 結(jié)論： 本研究表明： 1.小薊飲子全方及小薊飲子中的君藥、臣藥有減輕關(guān)木通腎毒性的作用； 2.小薊飲子全方及小薊飲子中的君藥、臣藥能減少關(guān)木通中馬兜鈴酸Ⅰ的含量； 3.小薊飲子全方及小薊飲子中的君藥、臣藥對關(guān)木通誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞的凋亡及TGFβ1的分泌水平有一定的抑制作用。