Caveolin-1調(diào)控肝細胞癌血管生成的初步研究.pdf

1、肝細胞癌(Hepatocellular carclnoma，HCC)是世界上最常見的實體惡性腫瘤之一，手術(shù)切除和肝移植仍是目前最有效的治療手段，但療效不佳，術(shù)后復發(fā)和轉(zhuǎn)移是其最主要原因。HCC是富血供腫瘤，血管生成被認為與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，腫瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞之間的相互作用參與了該過程。 Caveolin-1是細胞膜上內(nèi)陷微區(qū)域的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成過程中發(fā)揮著重要作用。目前，對caveolin-1

2、在不同腫瘤中的作用尚存在著兩種完全不同的觀點。Caveolin-1最初被認為是抑癌基因，但最近越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，caveolin-1過表達參與了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成。在有關(guān)HCC的研究中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)caveolin-1能抑制不同淋巴道侵襲能力小鼠HCC的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究所前期采用SuperArray基因芯片技術(shù)對HCC轉(zhuǎn)移相關(guān)基因進行篩選，發(fā)現(xiàn)caveolin-1是重要的促轉(zhuǎn)移候選基因之一。這些研究提示，caveolin-1參與了H

3、CC的侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成，但其機制有待進一步闡明。已有研究表明，血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是HCC血管生成中最主要的刺激因子，但多數(shù)研究caveolin-1與VEGF誘導血管生成之間的關(guān)系都集中在內(nèi)皮細胞上，而對腫瘤細胞上caveolin-1表達是否與VEGF誘導的血管生成有關(guān)尚不清楚。 基于以上研究背景，本研究采用免疫組織化學和細胞化學、qRT-PCR

4、及Westernblot技術(shù)檢測HCC組織標本和肝癌細胞株中caveolin-1的表達，并分析caveolin-1與HCC臨床病理學因素、VEGF及腫瘤血管生成相關(guān)指標(腫瘤微血管密度(MVD)、非成對動脈(UA))之間的相關(guān)性；利用慢病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建caveolin-1 RNA干擾載體，并借助qRT-PCR、ELISA、侵襲實驗和劃痕實驗分析其對人肝細胞癌株SMMC7721 VEGF表達和侵襲、運動能力的影響：利用MTT法和二維凝膠血

5、管生成體外模型探討下調(diào)SMMC7721細胞中caveolin-1表達的培養(yǎng)上清液對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(humanumbilical vein endothelial cells，HUVEC)增殖和VEGF誘導的血管生成的影響。 主要結(jié)果和結(jié)論如下： 第一部分：Caveolin-1在HCC中的表達及臨床意義 1、26例伴肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的HCC組織標本中，癌組織內(nèi)caveolin-1 mRNA表達水平高于正常肝組織、肝硬

6、化組織和癌旁組織，差異均具有統(tǒng)計學意義(P=0.046、0.021、0.039)。75例HCC組織標本行免疫組織化學檢測顯示，量化分析caveolin-1表達強度(P=0.001)、陽性百分比(P=0.002)、計分(P=0.001)均與轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。Caveolin-1表達強弱與VEGF(r=0.293，P=0.011)、MVD(r=0.361，P=0.001)、UA(r=0.388，P=0.001)均呈顯著正相關(guān)。生存分析發(fā)現(xiàn)，ca

7、veolin-1高表達患者預后比低表達者差(P=0.014)。單變量分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤大小、門靜脈癌栓、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、caveolin-1表達強弱、VEGF表達水平、MVD和UA都是HCC的重要預后因素；但多變量分析(COX回歸模型)發(fā)現(xiàn)，只有腫瘤大小和VEGF表達水平是其獨立預后因素，而caveolin-1表達水平并非其獨立預后因素。 2、在HepG2和SMMC7721肝癌細胞株中，免疫細胞化學結(jié)果顯示，Caveolin-1在SMMC

8、7721呈強陽性表達，而在HepG2中未見明顯表達；Western blot檢測結(jié)果與免疫細胞化學結(jié)果一致，且發(fā)現(xiàn)在SMMC7721中caveolin-1表達與VEGF高表達呈顯著正相關(guān)(r=0.888，P<0.01)；qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，SMMC7721細胞中caveolin-1mRNA表達水平明顯高于HepG2，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。侵襲實驗分析證實了SMMC7721的侵襲能力高于HepG2(P=0.003)。

9、 第二部分：Caveolin-1 RNAi慢病毒載體構(gòu)建及其對人肝細胞癌株SMMC7721VEGF表達和侵襲、運動能力的影響 1、成功構(gòu)建慢病毒系統(tǒng)介導的caveolin-1 RNAi載體，其可較長時間、穩(wěn)定表達于SMMC7721，感染5天后轉(zhuǎn)導效率為(96.0±1.2)％，并能顯著敲除靶細胞SMMC7721中目的基因caveolin-1的mRNA(敲除率約90％)和蛋白表達。 2、沉默Caveolin-1能顯著降

10、低SMMC7721細胞內(nèi)VEGF mRNA表達水平，相對陰性感染對照組下降水平約50％(P<0.05)； ELISA法檢測顯示分泌至胞外的VEGF蛋白水平表達約下降20％(P<0.05)。 3、Caveolin-1下調(diào)能顯著抑制SMMC7721的侵襲和運動能力，各個時相點相對對照組差異均有統(tǒng)計學意義(P均小于0.01)；給予外性性重組人VEGF后能顯著恢復其侵襲能力(P<0.05)，證實caveolin-1可通過調(diào)控VEGF參與

11、HCC的侵襲轉(zhuǎn)移。 第三部分：SMMC7721 Caveolin-1沉默培養(yǎng)上清液對HUVEC eNOS表達和內(nèi)皮細胞增殖、成管的影響 1、采用原代培養(yǎng)的HUVEC可較好的保持其純度和降低變異程度。Caveolin-1RNAi后SMMC7721培養(yǎng)上清液使HUVEC細胞活力顯著下降，增殖能力受到抑制，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 2、Caveolin-1 RNAi后SMMC7721細胞上清液能顯著抑制HUV

12、EC管腔結(jié)構(gòu)的形成(P<0.05)，給予外源性重組人VEGF后可恢復HUVEC管腔結(jié)構(gòu)的形成(P<0.05)，CD34標記的免疫組化檢測結(jié)果證實了該結(jié)果。 3、SMMC7721細胞caveolin-l沉默后上清液能顯著抑制HUVEC細胞上eNOSser-1177位點的磷酸化(P<0.05)，于24h抑制最為明顯，而eNOS總蛋白表達沒有發(fā)生變化。 綜上所述，本研究主要結(jié)論如下： 1、人HCC組織中caveolin

13、-1表達水平升高與腫瘤轉(zhuǎn)移、預后差和腫瘤血管生成顯著正相關(guān)；高侵襲潛能人肝細胞癌株SMMC7721中caveolin-1表達較高，并與VEGF表達升高呈顯著正相關(guān)。Caveolin-1可能是預測HCC侵襲轉(zhuǎn)移潛能和預后的指標之一。 2、利用慢病毒系統(tǒng)成功構(gòu)建的caveolin-1 RNAi載體可較長時間、穩(wěn)定表達于SMMC7721，并能顯著下調(diào)其caveolin-1的表達；沉默caveolin-1能顯著降低SMMC7721細胞內(nèi)

14、VEGF mRNA表達及其分泌至胞外的VEGF蛋白表達水平；Caveolin-1下調(diào)能顯著抑制SMMC7721的侵襲和運動能力，給予外源性重組人VEGF后能恢復其侵襲能力，證實caveolin-1可通過調(diào)控VEGF參與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移。 3、人肝細胞癌株SMMC7721中caveolin-1沉默引起的分泌型VEGF表達下調(diào)能顯著抑制HUVEC的增殖能力；利用基質(zhì)膠構(gòu)建的二維凝膠血管生成體外模型發(fā)現(xiàn)，caveolin-1沉默的人肝