膠原礦化仿生骨聯(lián)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白2相關多肽促進骨再生的實驗研究.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：BMP-2 相關多肽促進三維培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細胞成骨分化及礦化的實驗研究
　　 目的：評價BMP-2 相關多肽誘導體外三維培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細胞（bone marrowstromal cells，BMSCs）成骨分化及礦化的能力。
　　 方法：原代培養(yǎng)大鼠BMSCs，細胞傳至第3 代時，將細胞消化收集，與Cytodex TM3微載體三維培養(yǎng)體系復合培養(yǎng)，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)1d后，將培

2、養(yǎng)基換為成骨誘導培養(yǎng)基，實驗組培養(yǎng)基加入終濃度為200 μg/ml的BMP-2 相關多肽，對照組不加多肽。復合培養(yǎng)7天和14天后，進行死/活細胞染色，觀察微載體三維培養(yǎng)體系中BMSCs的存活情況，通過檢測細胞內(nèi)鈣含量和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色評價BMSCs 成骨分化情況，并進行鈣黃綠素染色評價細胞礦化情況。
　　 結果：細胞培養(yǎng)7天和14天后，BMSCs 在實驗組和對照組微載體三維培養(yǎng)體

3、系中均存活良好，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；實驗組鈣含量明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0 05)，實驗組ALP 陽性細胞明顯多于對照組，鈣黃綠素染色結果表明實驗組與對照組相比細胞礦化明顯。
　　 結論：BMP--2 相關多肽能夠有效促進體外三維培養(yǎng)的BMSCs 成骨分化及礦化。
　　 第二部分：納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關多肽復合材料的制備、特征及其對骨髓基質(zhì)干細胞生物學行為的影響

4、>　　 目的：制備納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關多肽復合材料，觀察其特征并評價其對大鼠骨髓基質(zhì)干細胞粘附、增殖及分化等生物學行為的影響。
　　 方法：用生物仿生自組裝的方法制備納米羥基磷灰石/膠原復合材料(nano-Hydroxyapatite/collagen,nHAC)，在此基礎上聯(lián)合聚乳酸 (poly lacticacid,PLA)制備膠原礦化骨仿生骨基質(zhì)材料——納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸（nano-H

5、ydroxyapatite/collagen/poly lactic acid,nHAC/PLA），用X 射線衍射儀分析其晶體結構，掃描電鏡觀察其表面微觀形貌，將納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸與BMP-2活性多肽復合，構建納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關多肽復合材料。取第三代BMSCs 接種到材料上，以未結合多肽的納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸作為對照，采用MTT法檢測BMSCs 在材料表面的增殖；沉淀法檢測BMSCs 在材料

6、表面的粘附率；掃描電鏡觀察比較BMSCs 在材料表面的生長形態(tài)；通過檢測細胞中的堿性磷酸酶活性及鈣離子濃度，觀察BMSCs 在材料表面的分化情況。
　　 結果：X 射線衍射分析結果顯示，納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸復合材料的主要成分是羥基磷灰石(HA)；掃描電鏡結果顯示：該復合材料是一種疏松多孔結構，孔徑從幾十微米至300μm不等，并且孔與孔之間有連通。細胞實驗結果表明：納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關多肽復合材料

7、與單純納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸相比，能夠促進BMSCs的粘附和向成骨細胞方向，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而對BMSCs的增殖能力沒有影響(P>0.05)。
　　 結論：BMP--2活性多肽可以顯著改善納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸復合材料的細胞相容性和生物活性，負載BMP-2活性多肽的納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸復合材料是一種理想的骨組織工程支架材料。
　　 第三部分：納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2

8、 相關多肽仿生骨基質(zhì)材料異位成骨的實驗研究
　　 目的：評價納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關多肽仿生骨基質(zhì)材料的異位成骨能力。
　　 方法：制備納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關多肽復合材料，采用高效液相色譜儀檢測不同時間點BMP-2 相關多肽的釋放量，觀察BMP-2 相關多肽的體外釋放規(guī)律。將48只成年雄性SD大鼠隨機分為四組，在A組、B組、C組大鼠背部肌肉內(nèi)分別植入3mg、2mg、1mg的B

9、MP-2 相關多肽與納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸復合材料；在D組大鼠背部肌肉內(nèi)植入單純納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸，于4 周和8 周兩個時間點將大鼠分批處死，經(jīng)CT 三維重建、組織學觀察及鈣含量測定檢測植入材料的異位成骨情況。
　　 結果：體外釋放實驗結果顯示BMP-2 相關多肽釋放規(guī)律為：第1天表現(xiàn)為爆發(fā)性釋放，釋放量為29.57%,以后緩慢持續(xù)釋放,至21d 累積釋放量達65.98%。A、B、C組，在各時間點的CT 三維重建

10、、組織學觀察及鈣含量檢測結果均表明其異位成骨能力優(yōu)于D組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中A、B 兩組的異位成骨能力差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）,但兩組均優(yōu)于C組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　 結論：BMP--2 相關多肽以納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸支架材料為載體能夠緩慢釋放。BMP-2 相關多肽可以顯著增強納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸的骨誘導活性，這種骨誘導性存在一定的劑量效應關系。納米羥基磷灰石/膠原

11、/聚乳酸/BMP-2 相關多肽復合材料能夠誘導異位骨形成，是一種具有良好骨誘導性的仿生骨修復材料。
　　 第四部分：納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關多肽仿生骨基質(zhì)材料促進大鼠顱骨缺損修復的實驗研究
　　 目的：探討納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關多肽仿生骨基質(zhì)材料促進大鼠顱骨缺損修復的可行性和有效性。
　　 方法：成年SD大鼠24只，在大鼠頂骨左、右兩側分別制備直徑5mm的顱骨缺損，左

12、側設為實驗組,植入納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關多肽復合材料，對側設為對照組，植入納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸，于4和12 周時間點將大鼠分批處死，進行大體觀察、CT 三維重建、組織學觀察、掃描電鏡觀察和透射電鏡觀察，取術后12周的標本進行Masson 三染、免疫組化染色和生物力學檢測，比較各組材料促進骨再生修復骨缺損的能力。
　　 結果：CT 三維重建結果顯示：實驗組4 周時可見片狀高密度影，12 周時可見骨缺

13、損完全愈合。對照組4 周時僅骨缺損邊緣可見輕微的片狀致密影，12 周時高密度影有所增強，面積增大，接近缺損面積的1/2，未能完全修復骨缺損。組織學觀察結果顯示術后4 周，實驗組骨缺損處可見大量新骨生成，而對照組僅有少量新骨生成；術后12周，實驗組可見大部分支架材料降解，新生骨與宿主骨之間達到完全骨性結合，對照組支架材料部分降解，殘余支架被新生骨組織包圍。在各時間點，實驗組新骨形成面積百分比均大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

14、掃描電鏡結果顯示：4 周時兩組材料部分降解，可見成骨細胞黏附和類骨質(zhì)形成，實驗組材料與正常骨組織有部分鍵合，對照組材料與正常骨組織間存在明顯間隙；12 周時實驗組材料大部分降解并由板層骨取代，骨缺損完全修復，對照組骨缺損部分修復。透射電鏡結果顯示：4 周時實驗組材料內(nèi)部可見功能活躍，代謝旺盛的成骨細胞，分泌的膠原排列無序，12 周時可見大量成骨細胞，在骨小梁表面成層排列，部分成骨細胞演變?yōu)楣羌毎?，膠原排列有序緊密。
　　 對照組

15、在材料周圍僅見少量成骨細胞，其分泌膠原功能不活躍。術后12 周時，Masson三染結果顯示實驗組骨缺損處存在大量紅色的成熟鈣化組織，對照組僅見少量綠色的新生骨樣組織。骨鈣素和骨橋蛋白免疫組化染色結果進一步印證了HE 染色和Masson 三染的發(fā)現(xiàn)，實驗組可見大量骨鈣素陽性和骨橋蛋白陽性的新生骨組織，明顯多于對照組骨鈣素陽性和骨橋蛋白陽性的骨組織。生物力學檢測結果顯示：實驗組最大壓力載荷和載荷/應變比值均明顯高于對照組差異有統(tǒng)計學意義（P