豬4個新基因的分離、物理定位及MyoG基因SNP研究.pdf

1、利用比較基因組學方法分離基因是一種新穎有效的方法，其基本原理是運用人、小鼠和豬等物種間存在的基因同源性，在基因的保守區(qū)設計引物分離基因，國內(nèi)外學者采用這種方法成功分離了豬的許多新基因。根據(jù)比較基因組學的研究，豬SSC11(susscrofachromosome11)和人HSA13(Homosapienschromosome13)間存在著很大同源性，人HSA13存在496個基因，估計SSC11至少也有400個基因，截止目前，豬11號染色體

2、上分離、定位的基因不足30個，所以豬SSC11新基因的分離、定位已勢在必行。本文成功分離了豬GAS6、POSTN、CDC16和EFNB2等4個新基因，并運用SCHP和IMpRH克隆板將這4個新基因進行了物理定位于SSC11，這對于豐富豬11號染色體的物理圖譜和了解不同物種染色體的進化具有重要的理論意義，并為這些基因功能的研究打下良好的基礎。 本論文根據(jù)比較基因定位信息，分離和物理定位了豬11號染色體上的4個新基因，并對MyoG基

3、因進行了SNP分型研究，取得了如下結果： 1.依據(jù)人13號、小鼠8號染色體上的同源基因保守序列設計引物，從寧鄉(xiāng)豬和大圍子豬基因組中分離了4個新基因的6個片段，并提交GenBank數(shù)據(jù)庫，這6個片段分別是豬GAS6基因內(nèi)含子9，POSTN基因內(nèi)含子18，CDC16基因內(nèi)含子4和內(nèi)含子8，EFNB2基因3'-UTR和內(nèi)含子3，GenBank收錄號分別為AY880668、AY880669、AY880670、DQ206823、AY880

4、671和DQ206822。 2.用豬×嚙齒類體細胞雜種板將4個新分離的豬基因進行染色體區(qū)域定位，將GAS6基因、CDC16基因和EFNB2基因定位于SSC11q11～q17，定位概率P分別為0.9976、0.9998和1.0000，與該區(qū)域標記間的相關系數(shù)分別為0.7906、0.8563和0.7802，誤差概率P都小于0.1％；將POSTN基因定位于SSC11p11～15，P=0.9992，與該區(qū)域標記間的相關系數(shù)為0.7031

5、，P＜0.1％。 3.用豬輻射雜種板將4個新分離的豬基因進行染色體精細定位，結果這4個基因均與豬11號染色體上的微衛(wèi)星標記緊密連鎖，GAS6基因與SW1452緊密連鎖，LOD=16.88，存留率為22％，在放射雜交圖譜上的圖距為56cR；POSTN基因與SW1486緊密連鎖，LOD=15.87，存留率為35％，在放射雜交圖譜上的圖距為67cR；CDC16基因與SW1452緊密連鎖，LOD=16.08，存留率為22％，在放射雜交圖

6、譜上的圖距為62cR；EFNB2基因與SW903緊密連鎖，LOD=6.86，存留率為29％，在放射雜交圖譜上的圖距為56cR。 4.將4個新基因的定位結果與已公布的豬11號染色體RH圖譜整合，獲得一張豬11號和人13號染色體的同源基因比較定位圖，發(fā)現(xiàn)這4個新基因在豬11號染色體上的排列順序是POSTN-GAS6-CDC16-EFNB2，后3個基因的排列順序與小鼠8號染色體上的完全相同，而與人13號染色體上排列順序POSTN-EF

7、NB2-GAS6-CDC16略有不同。 5.選擇遺傳差異較大的湖南地方品種大圍子豬和國外品種長白豬、大白豬各20頭，利用PCR產(chǎn)物直接測序法，在GAS6基因內(nèi)含子9第20、172和246bp位置發(fā)現(xiàn)3個SNP，均為A/G，在第28，136，257，263位置發(fā)現(xiàn)了4個突變，分別是A/G、G/C、A/G和A/G。6.選擇與人CDC16基因有高度同源(90％以上)的豬的BP436622、AJ656153、CJ022837和BP161

8、802等4個EST，構建毗連群，電腦克隆了豬CDC16基因cDNA，其長度為2057bp，其中5'-UTR為119bp，3'-UTR為75bp，ORF為長1863bp，編碼617個氨基酸。 7.分析了人、小鼠、大鼠、黑猩猩、豬和酵母等CDC16蛋白氨基酸序列差異，結果發(fā)現(xiàn)，豬與人、鼠和酵母的同源性分別為97.6％、95.3％、38.5％，大鼠和小鼠的同源性最高，其次是豬，然后是人。 8.通過分析與人CDC16基因有高度同

9、源性的4個EST(BP436622、AJ656153、CJ022837和BP1618O2)，發(fā)現(xiàn)4個候選的8NP，1個候選的14bp缺失突變(缺失序列GTTTGGAAACCCAG)。 9.通過PCR-RFLP方法，檢測了大約克豬、長白豬、杜洛克豬等外來品種和湖南地方品種寧鄉(xiāng)豬、沙子嶺豬、大圍子豬和桃源黑豬共831頭MyoG基因3'端353bp側翼序列，MspⅠ酶切后存在AA、AB和BB三種基因型，其中外來品種中BB占優(yōu)勢，B等位