FOXO3a-ChK3-XRCC1在納米二氧化鈦誘導(dǎo)L02細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中的作用研究.pdf

1、目的:納米二氧化鈦(nanoparticle titanium dioxide，Nano-TiO2)作為一種新型光催化劑、抗紫外線劑和光電效應(yīng)劑而被廣泛用在化妝品、抗菌防霉、環(huán)境污染治理、抗老化和汽車表面漆等領(lǐng)域。近來研究表明Nano-TiO2暴露于小鼠，以其小粒徑可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)炎癥反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致DNA受損，Nano-TiO2甚至可以穿透核膜進(jìn)入細(xì)胞核，直接與遺傳物質(zhì)DNA結(jié)合形成加合物，從而大大增加接觸者患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。不同晶

2、型和表面特征的Nano-TiO2對(duì)多種體外培養(yǎng)的細(xì)胞均可造成不同程度的DNA損傷（包括DNA斷裂、微核形成、DNA加合物形成等），這不僅和納米顆粒本身的物理特性有關(guān)，還和納米材料所致的遺傳毒作用機(jī)制密切相關(guān)。
　　雖然目前的研究對(duì)Nano-TiO2所引起的DNA損傷特點(diǎn)和類型進(jìn)行了較為細(xì)致的研究，但是其中所涉及的分子機(jī)制至今尚未闡明，因此對(duì)于Nano-TiO2誘導(dǎo)DNA損傷的可能機(jī)制成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　方法:
　

3、　1.細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞模型建立
　　人胚肝細(xì)胞株L02(中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心)于含10％熱滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2飽和濕度下培養(yǎng)。選對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用粒徑為25nm的Nano-TiO2染毒處理24小時(shí)，劑量為0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL;以DMEM為陰性對(duì)照。
　　2.細(xì)胞形態(tài)觀察
　　通過倒置顯微鏡觀察Nano-TiO2染毒后L02細(xì)胞形態(tài)的改變。
　　3.流式

4、細(xì)胞術(shù)檢測熒光探針標(biāo)記的ROS水平
　　以2，7-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)作為熒光探針，采用流式細(xì)胞檢測技術(shù)檢測不同劑量的Nano-TiO2處理L02細(xì)胞6h、24h后細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量。
　　4.彗星試驗(yàn)檢測DNA損傷
　　應(yīng)用彗星試驗(yàn)檢測L02細(xì)胞DNA損傷程度。
　　5.宿主細(xì)胞恢復(fù)活性實(shí)驗(yàn)(HCR)檢測細(xì)胞修復(fù)能力
　　氯化鎘(2μ mol/L)常溫?fù)p傷pGL3-Contro

5、l質(zhì)粒2小時(shí)，乙醇沉降法回收受損質(zhì)粒，TE溶解沉淀，質(zhì)粒濃度定容為1μg/μl。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染受損質(zhì)粒和pRL-TK質(zhì)粒，以不同濃度的Nano-TiO2處理L02細(xì)胞24小時(shí)后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測樣品中雙熒光素酶的表達(dá)情況，以熒光強(qiáng)度/μg蛋白含量分別表示蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的表達(dá)量，以蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的比值來反應(yīng)DNA修復(fù)能力。
　　6.熒光定量PCR檢測FOXO3a、ChK2、GADD45α及XRCC1

6、基因mRNA水平
　　納米二氧化鈦處理細(xì)胞后，Trizol提取細(xì)胞總RNA，TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄生成第一鏈cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測FOXO3a-ChK2/XRCC1信號(hào)通路中FOXO3a、ChK2、GADD45α及XRCC1基因mRNA水平的表達(dá)。
　　7.Western blot檢測FOXO3a、 ChK2、GADD45α及XRCC1蛋白表達(dá)水平
　　納米二氧化鈦處理細(xì)胞后收獲

7、，RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白，采用Western blot方法檢測FOXO3a-ChK2/XRCC1信號(hào)通路中FOXO3a、ChK2、GADD45α及XRCC1蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1 Nano-TiO2對(duì)L02細(xì)胞形態(tài)的改變
　　倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):正常培養(yǎng)的L02細(xì)胞為菱形，貼壁緊密生長，折光率高。染毒處理后，部分細(xì)胞皺縮為圓形，折光率減弱，貼壁能力下降，漂浮于培養(yǎng)液中。
　　2 Nano-T

8、iO2對(duì)L02細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響
　　隨著Nano-TiO2濃度的增加，ROS水平逐漸升高。當(dāng)Nano-TiO2濃度為0.1μg/mL，染毒6h和24h后，與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)Nano-TiO2濃度為1μg/mL、10μg/mL，染毒6h和24h后，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01);其中染毒6h后細(xì)胞內(nèi)ROS水平高于24h(P＜0.05)。
　　3 Nano-TiO2

9、對(duì)L02細(xì)胞DNA損傷的影響
　　Nano-TiO2處理細(xì)胞以后，各劑量組Olive尾矩增加，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，并有良好的劑量反應(yīng)關(guān)系(r=0.997，P＜0.05)。
　　4 Nano-TiO2對(duì)L02細(xì)胞修復(fù)能力的影響
　　隨著Nano-TiO2濃度的增加，蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的比值逐漸降低，L02細(xì)胞對(duì)DNA的修復(fù)能力逐漸降低，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜

10、0.05）。
　　5 Nano-TiO2對(duì)L02細(xì)胞中FOXO3a、 ChK2、GADD45α基因mRNA水平的表達(dá)
　　不同濃度的Nano-TiO2處理L02細(xì)胞后，隨著Nano-TiO2濃度的增加，F(xiàn)OXO3a基因mRNA的表達(dá)水平呈降低趨勢，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);ChK2基因mRNA的表達(dá)水平在1μg/ml和10μg/ml劑量組明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);GADD45α基

11、因mRNA的表達(dá)降低，其中1μg/ml和10μg/ml劑量組明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);XRCC1基因mRNA的表達(dá)水平0.1μg/ml劑量組升高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，1μg/ml和10μg/ml劑量組明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6 Nano-TiO2對(duì)L02細(xì)胞中FOXO3a、ChK2、GADD45α、XRCC1蛋白的表達(dá)水平
　　L02細(xì)胞經(jīng)不

12、同濃度的Nano-TiO2處理后，隨著Nano-TiO2濃度的增加，F(xiàn)OXO3a蛋白的表達(dá)降低，其中10μg/ml劑量組明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);ChK2蛋白表達(dá)水平在0.1μg/ml劑量組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而1μg/ml和10μg/ml劑量組明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);GADD45α蛋白的表達(dá)顯著降低，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);XRCC1蛋白

13、表達(dá)在1μg/ml、10μg/ml劑量組明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　1納米二氧化鈦?zhàn)饔糜贚02細(xì)胞時(shí)，可以使細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷。
　　2納米二氧化鈦可以誘導(dǎo)L02細(xì)胞發(fā)生DNA損傷并影響細(xì)胞對(duì)DNA損傷的修復(fù)能力。
　　3納米二氧化鈦染毒后，抑制了氧化應(yīng)激因子FOXO3a和生長阻滯與DNA損傷誘生蛋白45(GADD45α)的表達(dá)，抑制FOXO3a的抗氧化作