毛竹抗病PheWRKY1基因的克隆與功能分析.pdf

1、植物在長期進(jìn)化過程中形成了一個復(fù)雜的調(diào)控體系來抵御病害脅迫的影響，包括本身保護(hù)性生理屏障以及一系列抗病相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達(dá)。僅存在于植物中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，構(gòu)成轉(zhuǎn)錄因子超家族，廣泛參與植物抗逆反應(yīng)以及多種生理代謝過程。為了探討WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因在毛竹中的作用，本研究從毛竹(Phyllostachys edulis)中克隆了一個PheWRKY1基因，對其編碼蛋白的氨基酸序列及其表達(dá)特性進(jìn)行了分析，并將其在擬南芥(Arabidopsi

2、s thaliana)中增強(qiáng)表達(dá)，對所獲得的轉(zhuǎn)基因株系的抗病性進(jìn)行了初步研究。
　　通過RT-PCR技術(shù)，克隆得到PheWRKY1基因。序列分析表明，該基因全長1080 bp，包括一個579 bp開放閱讀框，編碼一個由193個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，相對分子量為20.8 KDa，等電點為5.99，基因注冊號為GU944762。序列分析表明，PheWRKY1基因的氨基酸序列含一個WRKY結(jié)構(gòu)域和一個鋅指結(jié)構(gòu)C2H2，屬于WRKYⅡ亞組。

3、PheWRKY1基因編碼蛋白的保守元件與禾本科植物甘蔗、水稻、小麥、黑麥草等有很高的一致性，在86％以上，與擬南芥中AtWRKY51同源性達(dá)47%。經(jīng)生物信息學(xué)軟件預(yù)測得知，PheWRKY1蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，蛋白的三級結(jié)構(gòu)與禾本科植物黑麥草類似，并且該蛋白具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能。
　　對毛竹實生苗進(jìn)行多種脅迫和誘導(dǎo)處理，提取葉片總RNA，用實時定量PCR方法分析目的基因表達(dá)模式。結(jié)果表明，外施抗病信號分子水楊酸（SA）和茉

4、莉酸（JA）均可以誘導(dǎo)PheWRKY1增強(qiáng)表達(dá)，但前者增強(qiáng)幅度更大，保持時間更長；紫外線B輻射也能誘導(dǎo)基因增強(qiáng)表達(dá)；外施脫落酸（ABA）和干旱脅迫，PheWRKY1表達(dá)無明顯變化。野外毛竹林中感染毛竹叢枝病與枯稍病樣本中 PheWRKY1基因表達(dá)也有所增強(qiáng)。提示PheWRKY1可能通過水楊酸和茉莉酸轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與病原菌誘導(dǎo)的信號傳遞，而不參與對滲透脅迫的反應(yīng)。
　　為研究PheWRKY1基因能否與順式作用元件的W盒結(jié)合，構(gòu)建了Phe

5、WRKY1基因的原核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入pET-28a，并使重組質(zhì)粒pET-WRKY在大腸桿菌中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到了有效的異源表達(dá)。
　　對PheWRKY1基因構(gòu)建植物過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，目前已經(jīng)得T2代轉(zhuǎn)基因株系。轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出不同的形態(tài)學(xué)特征，根系發(fā)達(dá)、葉片肥大、莖粗壯，提前開花且結(jié)種不良，推測PheWRKY1基因的過表達(dá)影響了轉(zhuǎn)基因株系的生長發(fā)育。
　　為進(jìn)一步分析 PheWRKY1基因是否調(diào)控植物抗病反應(yīng)

6、，本實驗用丁香假單胞菌Pseudomonas syringae PV Tomato DC3000(簡稱DC3000)侵染擬南芥，各實驗材料在1d會出現(xiàn)小的病斑，然后病斑會向四周擴(kuò)散。但隨后轉(zhuǎn)基因株系的病斑被局限在一個區(qū)域內(nèi)，周圍無明顯黃化壞死組織，而野生型的病斑會一直擴(kuò)散，周圍黃化，直至整片葉卷曲甚至枯萎。轉(zhuǎn)基因株系被侵染的整片葉以及剩余健康區(qū)域的Fv/Fm值和ΦPSⅡ值都高于野生植株。Y(NO)、Y(Ⅱ)、Y(NPQ)三個葉綠素?zé)晒鈪?/p>

7、數(shù)值的比例變化也存在差異，表現(xiàn)在被侵染的野生型植株的Y(NO)增長幅度高于被侵染的轉(zhuǎn)基因株系，由于三者之和為1，因此導(dǎo)致野生型植株后兩值的下降幅度也高于轉(zhuǎn)基因株系。這就意味著被侵染的轉(zhuǎn)基因株系整體光合性能和利用同等光強(qiáng)的能力優(yōu)于被侵染的野生型植株。病原菌侵染下PheWRKY1基因所調(diào)控的下游抗病相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生了變化。熒光定量PCR結(jié)果顯示，在被侵染葉片和未被侵染葉片中，轉(zhuǎn)基因和野生植株的抗病相關(guān)基因PR1，PR2，PR5，NPR1表