Ftx IncRNA編碼的miR-545、374a在HBV相關(guān)的肝癌中的變化及其意義.pdf

1、背景與目的：肝癌是全世界發(fā)病最多的癌癥之一。許多危險(xiǎn)因素與肝癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，包括慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染、慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染、飲食中黃曲霉毒素B1超量、飲酒過量和非酒精性脂肪性肝硬化。由于HCC的發(fā)病率的逐年提升，越來越多的研究著力于探究肝癌發(fā)生的細(xì)胞水平和分子水平的機(jī)制，希望能找到新的診斷肝癌的生物學(xué)標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。
　　本次研究在HBV相關(guān)的肝癌中監(jiān)測了miR-545/374a和miR-421/374b

2、的表達(dá)情況。通過與臨床指標(biāo)間的分析，希望探究microRNA調(diào)控腫瘤進(jìn)展的作用。體外細(xì)胞培養(yǎng)模型用于確認(rèn)microRNA的生物學(xué)效應(yīng)，并探究相關(guān)的調(diào)控機(jī)制。然后，遵從一個(gè)“從組織到血清，從術(shù)前到術(shù)后”的思路，探究了血清中的相應(yīng)的microRNA的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　第一部分 Ftx lncRNA編碼的microRNA在人類HBV相關(guān)的肝癌組織中的表達(dá)，及其與預(yù)后相關(guān)的臨床指標(biāo)的相關(guān)性
　　目的：1.探究Ftx編碼的miR-5

3、45、miR-374a、miR-421、miR-374b在人類HBV相關(guān)的肝癌組織中的表達(dá)變化;
　　2.選取與腫瘤的進(jìn)展和疾病預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵性臨床指標(biāo)探究在肝癌組織中發(fā)生差異表達(dá)的microRNA與它們的相關(guān)關(guān)系。
　　方法：1.選取在2012年2月份到2013年1月份于山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院行肝癌切除術(shù)的66例乙肝相關(guān)的肝癌病人，收集其腫瘤組織和遠(yuǎn)端無腫瘤肝臟組織;選取11例行肝血管瘤切除術(shù)的病人（陰性對(duì)照），收集其肝

4、臟組織;超低溫保存組織標(biāo)本以備檢測;
　　2.采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測組織標(biāo)本中miR-545、miR-374a、miR-421、miR-374b的表達(dá);
　　3.對(duì)HBV-HCC患者的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)分析，評(píng)價(jià)腫瘤的組織學(xué)分級(jí)、轉(zhuǎn)移、腫瘤包膜完整性和肝硬化情況;
　　4.One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test用于檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)定量數(shù)據(jù)是否正態(tài)分布;配對(duì)t檢驗(yàn)用于比較microRNA的表達(dá)量在配

5、對(duì)的HBV-HCC組織和無腫瘤組織中的差異;不配對(duì)的組織采用獨(dú)立t檢驗(yàn);Pearson分析用于檢驗(yàn)相關(guān)性;P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1.Ftx編碼的mr-545/374a在HBV-HCC組織中的表達(dá)發(fā)生了上調(diào)
　　2.miR-545/374a的表達(dá)與預(yù)后有關(guān)的臨床指標(biāo)明顯相關(guān)為了探究miR-545/374a在HBV相關(guān)的肝癌中起的作用，選取了與腫瘤的進(jìn)展和疾病預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵性的臨床指標(biāo)，分析miR-545/

6、374a與這些指標(biāo)是否具有相關(guān)性。
　　結(jié)論：1.Ftx編碼的miR-545/374a在HBV-HCC組織中的表達(dá)發(fā)生了上調(diào);
　　2.miR-545/374a的表達(dá)與腫瘤組織分化、轉(zhuǎn)移、腫瘤包膜完整性相關(guān)，提示miR-545/374a的高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤侵襲和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致患者的預(yù)后不良。
　　第二部分 HBV感染誘發(fā)miR-545/374a上調(diào)，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)展
　　目的：1.分析miR-545/374a

7、與慢乙肝感染相關(guān)的臨床指標(biāo)HBsAg、 HBV-DNA是否相關(guān);
　　2.探究HBV感染對(duì)miR-545/374a表達(dá)的影響;
　　3.探究HBx蛋白對(duì)miR-545/374a的調(diào)控作用;
　　4.探究miR-545/374a過表達(dá)對(duì)于腫瘤的增殖、遷移和侵襲能力的影響。
　　方法：1.培養(yǎng)人類肝癌細(xì)胞系Bel-7402、HepG2、穩(wěn)定的HBV陽性表達(dá)的細(xì)胞系HepG2.2.15;按照密度2.0xi05個(gè)細(xì)胞/m

8、L種植細(xì)胞到六孔板中，轉(zhuǎn)染前無血清饑餓24小時(shí);
　　2.野生型的編碼HBV全基因組的質(zhì)粒pCDNA3.1-HBV，或者編碼HBx蛋白全長的質(zhì)粒pIRSE-HBx，以LipofectamineTM2000為介質(zhì)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，空白表達(dá)的質(zhì)粒作為對(duì)照組;采用高敏熒光實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白印記驗(yàn)證質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功;
　　3.GenePharma合成的miR-545的類似物、抑制物、miR-374a的類似物、抑制物，以及他們的陰性對(duì)照寡核

9、苷酸鏈以Lipofectamine2000為介質(zhì)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，無義寡核苷酸鏈作為對(duì)照;
　　4.采取細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)探究miR-545/374a的過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響，采用覆蓋Matrigel的transwell小室實(shí)驗(yàn)來探究細(xì)胞侵襲能力，采用不覆蓋matrigel的transwell小室實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行探究細(xì)胞遷移能力;
　　5.采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件用于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義通過獨(dú)立組間學(xué)生t檢驗(yàn)，P＜

10、0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1.HBV感染對(duì)miR-545/374a表達(dá)水平的影響
　　2.HBx蛋白對(duì)miR-545/374a表達(dá)的調(diào)控作用HBx蛋白是HBV感染過程中一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子。因此，我們監(jiān)測了HBx蛋白在66對(duì)HBV相關(guān)的肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況。
　　3.miR--545/374a高表達(dá)對(duì)于肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響
　　結(jié)論：1.HBeAg指標(biāo)陽性或者HBV-DNA陽

11、性的患者,miR-545/374a表達(dá)水平較陰性患者升高;
　　2.HBV感染能夠上調(diào)miR-545/374a的表達(dá)，HBx是這個(gè)過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子;
　　3.miR-545/374a高表達(dá)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。
　　第三部分 血清中miR-545/374a的表達(dá)與組織的對(duì)應(yīng)關(guān)系，及其在臨床診斷中的價(jià)值
　　目的：1.探究血清miR-545/374a表達(dá)與肝癌組織miR-545/374a表達(dá)的對(duì)應(yīng)

12、關(guān)系;
　　2.探究HBV相關(guān)的肝癌患者血清miR-545/374a的表達(dá)水平與陰性對(duì)照之間的差異，評(píng)價(jià)miR-545/374a診斷腫瘤發(fā)生的臨床意義;
　　3.探究血清miR-545/374a在腫瘤切除術(shù)前、術(shù)后的變化趨勢(shì);
　　4.分析術(shù)前血清中miR-545和miR-374a的表達(dá)量與患者預(yù)后相關(guān)的臨床指標(biāo)的關(guān)系。
　　方法：1.收集66例HBV相關(guān)的肝癌患者的血液標(biāo)本，包括術(shù)前5ml靜脈血、手術(shù)20天以后

13、復(fù)查的5ml靜脈血，低溫保存待檢;
　　2.收集患者的年齡、性別、HBV-DNA、甲胎蛋白(AFP)，癌胚抗原(CEA)，gamma谷胱甘肽(γ-GT)等臨床指標(biāo)，以備相關(guān)性檢驗(yàn);
　　3.配對(duì)t檢驗(yàn)用于比較microRNA的表達(dá)量在術(shù)前、術(shù)后血清中的差異，不配對(duì)的組織采用獨(dú)立t檢驗(yàn);Pearson分析用于檢驗(yàn)相關(guān)性;P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1.HBV相關(guān)的肝癌患者血清中的miR-545/374a表

14、達(dá)情況，及其與組織表達(dá)的對(duì)應(yīng)關(guān)系
　　2.血清miR-545/374a在腫瘤切除術(shù)前、術(shù)后的變化趨勢(shì)
　　結(jié)果顯示，miR-545的表達(dá)降低了47.3％(p=0.001)，而miR-374a的表達(dá)降低了45.8％(p=0.042)，這進(jìn)一步證實(shí)了血清miR-545/374a是腫瘤來源的。每個(gè)患者術(shù)前和術(shù)后miR-545/374a水平的連線圖就像之前假設(shè)的那樣，幾乎所有的患者的miR-545/374a表達(dá)水平都發(fā)生了下調(diào)。

15、r>　　3.術(shù)前血清中miR-545和miR-374a的表達(dá)水平與患者預(yù)后/診斷相關(guān)的臨床指標(biāo)的相關(guān)分析
　　用實(shí)時(shí)定量PCR檢測了66例HBV相關(guān)的肝癌組織中miR-545和miR-374a的表達(dá)，分析它們與預(yù)后/診斷相關(guān)的指標(biāo)的相關(guān)性。每一個(gè)分化等級(jí)的肝癌患者與陰性對(duì)照患者相比，他們血清中miR-545和miR-374a的水平都有明顯的差異，但是不同的分化等級(jí)的患者組中，沒有觀察到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異的差別。發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌患者和

16、沒有發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌患者相比，他們的血清中miR-545和miR-374a的水平?jīng)]有明顯的差異。接下來，我們分析了三個(gè)已經(jīng)建立的比較完善的預(yù)測肝癌腫。AFP陽性(≥20ng/ml)的患者比AFP陰性的患者，miR-545/374a的表達(dá)水平明顯較高(p=0.012，p=0.009，independent t test)。然而，miR-545/374a的表達(dá)水平和CEA或者γ-GT沒有明顯的相關(guān)性。
　　結(jié)論：1.HBV相關(guān)的肝癌患者

17、中，血清miR-545和miR-374a的表達(dá)明顯上調(diào)，且其表達(dá)與肝癌組織中的表達(dá)相一致，證明血清miR-545/374a的表達(dá)能夠提示HBV相關(guān)的肝癌的發(fā)生;
　　2.腫瘤切除術(shù)后，肝癌患者的血清中miR-545和miR-374a的表達(dá)發(fā)生了明顯下調(diào)，提示血清miR-545和miR-374a是腫瘤來源的;
　　3.AFP陽性的患者相較AFP陰性的患者，miR-545/374a的表達(dá)水平明顯較高;但miR-545/374a的