C2C12細(xì)胞成肌分化基因芯片統(tǒng)合分析及Lrrc75b對(duì)成肌分化的作用.pdf

1、[目的]：
　　1.對(duì)C2C12細(xì)胞成肌分化芯片進(jìn)行統(tǒng)合分析，篩選出C2C12細(xì)胞成肌分化一致性差異表達(dá)基因集，并采用生物信息學(xué)軟件分析成肌分化相關(guān)基因本體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　2.探討差異表達(dá)基因Lrrc75b對(duì)C2C12細(xì)胞成肌分化的影響及作用機(jī)制。
　　[方法]：
　　1.采用dChip軟件對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫中C2C12成肌分化芯片GSE4694、GSE5447、GSE5305進(jìn)行分析。采用GATHER軟件對(duì)一

2、致性上調(diào)（或下調(diào)）基因集進(jìn)行基因本體、KEGG Pathway富集分析。
　　2.用2％馬血清對(duì)C2C12細(xì)胞進(jìn)行成肌分化誘導(dǎo)，顯微鏡下觀察成肌分化0d，1d，3d，5d的細(xì)胞形態(tài)變化及肌管形成;收集成肌分化0d，1d，3d，5d蛋白質(zhì)，Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測成肌標(biāo)志蛋白myogenin，MyHC的表達(dá)情況。
　　3.用2％馬血清對(duì)C2C12細(xì)胞進(jìn)行成肌分化誘導(dǎo)，提取成肌分化0d，1d，3d，5d細(xì)胞RNA，qRT-PC

3、R檢測Lrrc75b在成肌分化過程的時(shí)序表達(dá)模式。
　　4.Lrrc75b stealth RNAi轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，進(jìn)行成肌分化誘導(dǎo)，于第3d進(jìn)行免疫熒光染色，觀察肌管形成情況;Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測成肌分化0h，12h，24 h，48 h，72 h myogenin，MyHC蛋白表達(dá)情況及成肌分化0h，24 h，48h，72 h ERK1/2蛋白的表達(dá)變化。
　　5.Lrrc75b重組腺病毒感染C2C12細(xì)胞，進(jìn)行

4、成肌分化誘導(dǎo)，于第5d進(jìn)行免疫熒光染色，觀察肌管形成情況;Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測成肌分化0d，1d，3d，5 d myogenin，MyHC蛋白表達(dá)情況及ERK1/2蛋白的表達(dá)變化。
　　[結(jié)果]：
　　1.通過對(duì)C2C12成肌分化基因芯片進(jìn)行分析，篩選出GSE4694中上調(diào)表達(dá)基因1497個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因1539個(gè);GSE5447中上調(diào)表達(dá)基因2378個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因2439個(gè);GSE5305中上調(diào)表達(dá)基因1177個(gè)，

5、下調(diào)表達(dá)基因2101個(gè)。對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)合分析，在2個(gè)及以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中均出現(xiàn)差異表達(dá)的一致性上調(diào)表達(dá)基因集932個(gè)，一致性下調(diào)表達(dá)基因集1198個(gè)。GATHER軟件分析表明:一致性上調(diào)表達(dá)基因集中富集GO:0006936(muscle contraction)，GO:0007517(muscle development)等基因本體;mmu04910(Insulin signalling pathway)，mmu04020(Calcium

6、 signalling pathway), mmu04010(MAPK signaling pathway)等信號(hào)通路。而一致性下調(diào)表達(dá)基因集中主要富集GO:0007049(cell cycle)，GO:0008283(cell proliferation)等基因本體;mmu00240(Pyrimidine metabolism)，mmu00230(Purine metabolism)等代謝相關(guān)信號(hào)通路。
　　2.C2C12細(xì)胞形

7、態(tài)呈梭形，均一;當(dāng)細(xì)胞處于成肌分化誘導(dǎo)液培養(yǎng)，2d后細(xì)胞開始融合，出現(xiàn)兩個(gè)核以上的肌管，隨著成肌誘導(dǎo)時(shí)間的延長，肌管數(shù)量逐漸增加，肌細(xì)胞逐漸融合，肌管逐漸變大變長。Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示成肌分化過程成肌分化標(biāo)志蛋白myogenin，MyHC表達(dá)逐漸增加。
　　3.基因芯片分析結(jié)果提示Lrrc75b在成肌分化中表達(dá)下調(diào)。在C2C12成肌分化模型，qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步證明，成肌分化過程Lrrc75b mRNA表達(dá)水平逐漸降

8、低。
　　4.免疫熒光染色結(jié)果顯示，與si-Control組比較，si-Lrrc75b組肌管面積、肌管融合指數(shù)明顯增加，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與Ad-GFP組比較，過表達(dá)Ad-Lrrc75b組肌管面積、肌管融合指數(shù)明顯減少，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.與si-Control組比較，sj-Lrrc75b組成肌標(biāo)志蛋白myogenin，MyHC的表達(dá)量明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.

9、05);與Ad-GFP組比較，過表達(dá)Ad-Lrrc75b組myogenin蛋白表達(dá)量明顯減少，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.與si-Control組比較，si-Lrrc75b組抑制ERK1/2磷酸化水平;與Ad-GFP組比較，過表達(dá)Ad-Lrrc75b組上調(diào)ERK1/2磷酸化水平。
　　[結(jié)論]：
　　1.成肌分化芯片Meta分析結(jié)果顯示，一致性上調(diào)表達(dá)基因集932個(gè)，一致性下調(diào)表達(dá)基因集1198個(gè)

10、，其中Lrrc75b是一致性下調(diào)表達(dá)基因。
　　2.在C2C12細(xì)胞成肌分化模型，伴隨成肌分化的發(fā)生，Lrrc75b mRNA表達(dá)水平逐漸降低，與基因芯片Meta分析結(jié)果相符合。
　　3.在C2C12成肌分化過程，通過RNAi方法特異性降低Lrrc75b基因表達(dá)，肌管面積、肌管融合指數(shù)明顯增加;myogenin，MyHC蛋白表達(dá)量明顯增加。結(jié)果表明下調(diào)Lrrc75b表達(dá)，促進(jìn)C2C12細(xì)胞成肌分化。
　　4.通過重組腺