肌特異性miRNA在肌細(xì)胞分化中的作用及對(duì)肌營(yíng)養(yǎng)不良的影響.pdf

1、目的：
　　系統(tǒng)檢測(cè)肌特異性miRNA在肌細(xì)胞增殖和分化成熟過程中的變化以及在肌營(yíng)養(yǎng)不良病人中的表達(dá)，初步探討miRNA與肌營(yíng)養(yǎng)不良的關(guān)系。結(jié)合細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)以及生物信息學(xué)網(wǎng)站，探討miRNA過表達(dá)對(duì)成肌細(xì)胞分化及靶基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究miRNA在肌營(yíng)養(yǎng)不良發(fā)病過程中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.培養(yǎng)成肌細(xì)胞株C2C12，實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)肌特異性miRNA（-1，-133a，-206）在

2、肌細(xì)胞增殖期和分化過程中的表達(dá)。
　　2.結(jié)合臨床表現(xiàn)、HE染色和肌酶組化、特殊染色方法，篩選肌營(yíng)養(yǎng)不良病例。以非特異性改變肌組織為對(duì)照組，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)肌營(yíng)養(yǎng)不良病人肌特異性miRNA（-1，-133a，-206）的表達(dá)。
　　3.通過以上實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)成肌細(xì)胞分化及肌營(yíng)養(yǎng)不良影響較為明顯的肌特異性miRNA，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)該miRNA可能作用的靶基因。
　　4.合成該miRNA的mimic，轉(zhuǎn)染成肌細(xì)

3、胞C2C12，利用MTT法檢測(cè)過表達(dá)該miRNA對(duì)C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，光學(xué)顯微鏡觀察成肌細(xì)胞生長(zhǎng)分化情況，同時(shí)qRT-PCR、Western blot進(jìn)行靶基因表達(dá)檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1. miR-1，-133a，-206在增殖期的表達(dá)量較低，與增殖期比較，隨著成肌細(xì)胞分化時(shí)間的延長(zhǎng)，肌特異性miR-1，-133a，-206表達(dá)均顯著升高（P值分別為0.0002、0.005、0.0001），其中miR-1表達(dá)升

4、高最明顯。
　　2.篩選8例肌營(yíng)養(yǎng)不良標(biāo)本，與非特異性改變肌組織對(duì)比，miR-1，-133a，-206表達(dá)均升高，其中 miR-206在肌營(yíng)養(yǎng)不良病人的肌組織表達(dá)升高最顯著（P=0.04）。
　　3.通過miRDB、miRNA.org、TargetScanHuman6.2、Pictar等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-206在肌細(xì)胞分化及肌營(yíng)養(yǎng)不良發(fā)病過程的靶基因Pax7、Pax3、Cx43、Hmgb3。
　　4.C2C12

5、細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-206mimic后，qRT-PCR顯示Pax7、Pax3、Cx43、Hmgb3表達(dá)明顯下降。Western blot顯示Pax7、Pax3、Cx43、Hmgb3蛋白表達(dá)下降。
　　5.C2C12細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-206mimic后，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞增殖受到明顯抑制。與陰性對(duì)照（NC組）相比，MTT法檢測(cè)顯示C2C12抑制率為（21.35±0.0068）％（P=0.004）
　　結(jié)論：
　　1.miR-1