番茄SYTA克隆表達(dá)及番茄SYTA互作蛋白篩選.pdf

1、在動(dòng)物及擬南芥基因組中，突觸結(jié)合蛋白基因（synaptotagmin，SYT）是作為含有 C2結(jié)構(gòu)域的基因廣泛存在。目前已發(fā)現(xiàn)大量包含C2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，其中大多數(shù)參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或膜轉(zhuǎn)運(yùn)。SYT都包含五個(gè)結(jié)構(gòu)域:囊泡內(nèi)N–端結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域，胞質(zhì)中C2A，C2B，C–端結(jié)構(gòu)域，其中C2A，C2B是行使功能的主要結(jié)構(gòu)域。擬南芥基因組中含有6個(gè)SYT同源基因,分別命名為SYTA–F。已報(bào)道擬南芥SYTA在擬南芥鹽脅迫應(yīng)答信號(hào)途徑中起著重

2、要調(diào)節(jié)作用。近期研究表明擬南芥SYTA能與TMV的運(yùn)動(dòng)蛋白相互作用，在沉默SYTA的擬南芥中TMV運(yùn)動(dòng)蛋白的擴(kuò)散受到抑制。
　　番茄作為茄科植物的代表，是研究蔬菜中果實(shí)發(fā)育和成熟過裎的典型植物。本研究以2012年完成的番茄基因組測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)，經(jīng)比對(duì)有SYTA同源基因存在。為了明確番茄中SYTA的亞細(xì)胞定位及篩選預(yù)期互作的寄主蛋白，本研究以室內(nèi)番茄幼苗為材料，克隆番茄SYTA同源基因，進(jìn)行植物表達(dá)分析，并且在茄科植物煙草cDNA文庫(kù)中

3、用酵母雙雜交篩選互作基因，測(cè)序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)SYTA可與煙草鐵氧還蛋白I（ferredoxin I，F(xiàn)d–I）在酵母細(xì)胞內(nèi)直接互作。研究結(jié)果如下：
　　根據(jù)發(fā)表的番茄基因組序列中SYTA同源基因序列，設(shè)計(jì)SYTA特異引物，以番茄總RNA為模板，RT–PCR克隆獲得1620bp的目的條帶，測(cè)序比對(duì)顯示其與番茄基因組SYTA核苷酸相似性為98．9％，氨基酸比對(duì)結(jié)果顯示：其與番茄基因組SYTA僅僅第88個(gè)氨基酸由賴氨酸突變?yōu)楣劝彼?；與擬南芥

4、、林煙草、絨毛狀煙草、黃瓜、芝麻、可可和胡楊SYTA核苷酸相似性分別為71.1％、91.1％、91.1％、71.2％、83.1％、80.9％和79.4％；氨基酸相似性分別為73.6%、91.2%、91.2%、71.6%、79.6%、81.1%和79.6%。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)結(jié)果表明番茄SYTA與擬南芥蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)類似，在結(jié)構(gòu)上具有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（從羧基端到氨基端）、一個(gè)連接膚鏈和兩個(gè)處于胞質(zhì)中的C2結(jié)構(gòu)域。
　　將番茄SYT

5、A構(gòu)建到植物表達(dá)載體，獲得與EGFP融合表達(dá)的植物表達(dá)載體Ppzp–SYTA–EGFP.經(jīng)根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株介導(dǎo)在本氏煙葉片細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)，共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)番茄SYTA與擬南芥SYTA類似，大多分布到細(xì)胞膜，并且在及細(xì)胞質(zhì)周緣也有少許分布。
　　將番茄SYTA構(gòu)建至酵母雙雜交載體pSTT91，獲得pSTT91–SYAT，酵母雙雜交篩選煙草cDNA文庫(kù)，經(jīng)X–gal檢測(cè)為陽(yáng)性的克隆，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)

6、現(xiàn)篩選到的蛋白對(duì)應(yīng)基因比煙草鐵氧還蛋白I（Ferredoxin I，F(xiàn)d–I）少10個(gè)核苷酸。將與煙草Fd–I同源的番茄Fd–I全長(zhǎng)構(gòu)建至酵母雙雜交載體pGAD424，pGAD424–Fd–I，將pGAD424–Fd–I和pSTT91–SYTA共轉(zhuǎn)酵母細(xì)胞L40，可以在三缺培養(yǎng)基上長(zhǎng)出克隆，X–gal檢測(cè)為陽(yáng)性，表明番茄SYTA可以與番茄Fd–I在酵母細(xì)胞中相互作用。前期研究表明番茄Fd–I可與ToMV CP相互作用，結(jié)合我們的結(jié)果，我