桑葉提取物通過NF-κB信號(hào)通路改善KKAy小鼠胰島素抵抗的機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　目前，世界上超過1.5億人為2型糖尿病患者，到2020年人數(shù)將會(huì)增加2倍。2型糖尿病患者大多體型肥胖，且常伴有高脂血癥，如果治療不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，如腎衰、失明、視神經(jīng)炎、傷口愈合慢、動(dòng)脈?。òü跔顒?dòng)脈疾?。┑?。目前國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者認(rèn)為2型糖尿病可能是由炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)的一種免疫性疾病，此觀點(diǎn)被稱為2型糖尿病的“炎癥學(xué)說”，2型糖尿病的炎癥機(jī)制自此成為糖尿病學(xué)者研究的熱點(diǎn)。
　　研究者發(fā)現(xiàn)，炎癥因子的過度分泌

2、及炎癥通路的持續(xù)激活導(dǎo)致的慢性炎癥狀態(tài)，可能誘發(fā)胰島素抵抗以及糖尿病的發(fā)生。細(xì)胞核因子KappaB(NF-κB)是廣泛分布于細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)過程中起重要作用。IκBα是轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制劑，由于IκBα的存在，NF-κB在細(xì)胞質(zhì)中處于靜止?fàn)顟B(tài);許多細(xì)胞外免疫刺激物誘導(dǎo)IκKβ活化，作用于IκBα使其磷酸化，誘導(dǎo)NF-κB與IκBα解離，NF-κB被活化，進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控相關(guān)炎性因子的表達(dá)，過度表達(dá)的促炎因子是導(dǎo)致胰島素

3、抵抗的一個(gè)重要因素。研究桑葉提取物對(duì)高胰島素誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞及自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠中NF-κB信號(hào)通路的影響，在2型糖尿病的治療過程中具有重要臨床意義。
　　目前，用于治療2型糖尿病藥物分為胰島素和口服降糖藥，口服降糖藥主要分為如胰島素促泌劑、胰島素增敏劑、α-葡萄糖苷酶抑制劑以及雙胍類等傳統(tǒng)降糖藥;隨著藥物的發(fā)展一些新型降糖藥也已逐漸進(jìn)入臨床使用，如:GLP-1激動(dòng)劑---艾賽那肽和利拉普泰，DPP-4抑制劑---西

4、格列汀和維格列汀，SGLT-2抑制劑和GPR119激動(dòng)劑等，但這些新藥僅僅通過幾千例患者，可能會(huì)掩蓋很多情況，對(duì)于其實(shí)際療效、安全性及副作用還有待于臨床積累資料，因此目前臨床還是主要采用傳統(tǒng)降糖藥，但西藥治療雖然能從表面快速降低血糖，但不能從根本上降低糖尿病的發(fā)生，而且還存在許多副作用，因此尋找降糖中藥成了新的治療策略。中藥作為中國(guó)特色的傳統(tǒng)醫(yī)藥，在治療2型糖尿病及其并發(fā)癥方面進(jìn)行了大量的實(shí)踐，同時(shí)積累了大量的臨床經(jīng)驗(yàn)，已被廣泛用于2型

5、糖尿病的治療，是進(jìn)一步研究和開發(fā)降糖新藥的寶貴資源。桑葉為?？浦参锷５母稍锶~，屬甘寒之品，具有降血壓、血脂、抗炎等作用，在民間曾廣泛用于治療消渴病，本課題組也一直致力于桑葉降糖的研究，從原材料的選取，桑葉有效提取物的提取分離及純化，到降糖機(jī)制，進(jìn)行了一系列的研究。
　　根據(jù)文獻(xiàn)分析及課題組前期研究基礎(chǔ)，本文章分別以HepG2細(xì)胞及自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠為研究對(duì)象，觀察桑葉生物堿(Mulberry leaves Alkaloi

6、ds，MLE)、桑葉多糖（Mulberry leaves polysaccharides，MLP）、桑葉黃酮(Mulberryleaves flavonoids，MLF)對(duì)高胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞及自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因、蛋白及炎癥因子表達(dá)的影響，探討桑葉提取物對(duì)2型糖尿病可能產(chǎn)生的保護(hù)作用，以便為其臨床應(yīng)用提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體如下:
　　第一部分桑葉提取物對(duì)IR-HepG2細(xì)胞NF-κB信號(hào)

7、通路相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　目的：建立HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗模型，探討桑葉有效部位對(duì)模型細(xì)胞IκBα、IκKβ基因mRNA表達(dá)及NF-κB活化的影響。
　　方法：以人肝癌HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，10μg·mL-1胰島素培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h，建立胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞(IR-HepG2)模型;將IR-HepG2模型細(xì)胞隨機(jī)分為模型組，總多糖組，總黃酮組，總生物堿組，羅格列酮組，分別體外培養(yǎng)胰島素抵抗的HepG2細(xì)

8、胞，另以HepG2細(xì)胞作為正常對(duì)照組，cck8法檢測(cè)胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞的增值，葡萄糖氧化酶法(GOD-POD)檢測(cè)細(xì)胞上清液中葡萄糖含量，確定各實(shí)驗(yàn)組的最佳干預(yù)濃度。RT-qPCR法檢測(cè)IKKβ、IκBαmRNA的表達(dá)，Western Blot法檢測(cè)IκBα蛋白表達(dá)反映NF-kB的活性。
　　結(jié)果：高胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗后，IKKβ表達(dá)量明顯增加，NF-κB活性增加;應(yīng)用桑葉提取物干預(yù)后，桑黃酮、多糖、生

9、物堿可以降低IKKβmRNA、IκBα mRNA的表達(dá);且桑黃酮、生物堿可以抑制IκBα降解，抑制NF-κB的活性。
　　結(jié)論：高胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗后，NF-κB信號(hào)通路在一定程度上被激活，表明胰島素抵抗與NF-κB炎癥通路間存在一定的關(guān)系;桑葉提取物能夠抑制NF-κB的活化，從而為桑葉用于臨床防治2型糖尿病提供了一定的理論依據(jù)。
　　第二部分桑葉提取物對(duì)自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠糖代謝的影響
　

10、　目的：觀察桑葉各提取物（多糖，黃酮，生物堿）對(duì)自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠糖代謝的影響。
　　方法：預(yù)實(shí)驗(yàn)確定各藥物組給藥劑量。根據(jù)體重、血糖將KKAy小鼠隨機(jī)分為5組，分別設(shè)模型組(IR)，桑多糖(MLP,1000 mg·kg-1)、桑黃酮(MLF，1000mg·kg-1)、桑生物堿(MLA，30 mg·kg-1)和羅格列酮(RSG，2 mg·kg-1)，每組各6只，另以10只C57BL/6小鼠為正常對(duì)照組(NC)。實(shí)驗(yàn)中，K

11、KAy小鼠喂飼專屬飼料，C57BL/6小鼠喂飼普通飼料，各給藥組灌胃給藥，模型組與正常組以純水灌胃，1次/d，共4周，每周記錄1次體質(zhì)量，每周每組隨機(jī)取2-3只小鼠測(cè)定空腹血糖。末次給藥后1h，水合氯醛腹腔麻醉，打開腹腔，迅速剝離肝臟、附睪脂肪，稱重，計(jì)算肝臟和附睪脂肪系數(shù)，置于液氮中保存用于檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組肝糖原含量。
　　結(jié)果：桑葉各提取物（多糖，黃酮，生物堿）均能夠降低KKAy小鼠體重，肝臟指數(shù)以及附睪脂肪系數(shù)，降低附睪脂肪重量

12、，不同程度改善KKAy小鼠的空腹血糖水平，明顯增加肝糖原含量，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論：桑葉各提取物（多糖，黃酮，生物堿）可減輕自發(fā)型2型糖尿病KKAy小鼠體重，降低空腹血糖，增加肝糖原含量，有利于血糖的長(zhǎng)期穩(wěn)定控制，同時(shí)抑制小鼠由于高糖狀態(tài)而引起的肝臟，脂肪組織腫大。
　　第三部分桑葉提取物對(duì)自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠血清因子的影響
　　目的：觀察桑葉提取物（多糖，黃酮，生物堿）自發(fā)性2

13、型糖尿病KKAy小鼠血清炎癥因子IL-6、CRP以及TNF-α的影響。
　　方法：隨機(jī)將KKAy小鼠分為5組，分別設(shè)模型組(IR)，桑多糖(MLP,1000mg/kg)、桑黃酮（MLF，1000mg/kg）、桑生物堿（MLA，30mg/kg）和羅格列酮（RSG，2mg/kg），每組各6只，另以10只C57BL/6小鼠為正常對(duì)照組(NC)。實(shí)驗(yàn)干預(yù)如上。末次給藥后1h，水合氯醛腹腔麻醉，斷頭取血，3000r/min，離心15min，

14、取血清，-70℃保存。按照ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：與正常對(duì)照C57BL/6小鼠相比，模型組KKAy小鼠血清IL-6、CRP、以及TNF-α含量明顯增加(P＜0.01);桑葉干預(yù)4周后，與模型組比較，各給藥組KKAy小鼠血清IL-6、CRP、TNF-α含量明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：桑葉通過調(diào)節(jié)血清IL-6、CRP以及TNF-α的水平，減輕KKAy小鼠的胰島素抵抗，從而恢復(fù)正常代謝。
　　第四部分

15、桑葉提取物對(duì)自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠肝臟及附睪脂肪組織中蛋白IκKβ、p-IκBα表達(dá)的影響
　　目的：探討桑葉提取物（多糖，黃酮，生物堿）對(duì)自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠肝臟及附睪脂肪組織中蛋白IκKβ、p-IκBα表達(dá)的影響。
　　方法：從液氮中拿出肝臟及附睪脂肪組織，放入研缽中，液氮研磨成粉末，加入組織裂解液和蛋白酶抑制劑的混合物繼續(xù)研磨至勻漿，RIPA裂解取上清，即蛋白液。BCA法檢測(cè)蛋白濃度，Western Bl

16、ot法檢測(cè)兩種組織中蛋白IκKβ、p-IκBα表達(dá)。
　　結(jié)果：與正常對(duì)照組(NC)相比，模型組KKAy小鼠肝臟及附睪組織中蛋白IκKβ、p-IκBα表達(dá)升高（P＜0.01）;藥物干預(yù)后，與模型組相比，各實(shí)驗(yàn)組肝臟及附睪組織中蛋白IκKβ、p-IκBα表達(dá)降低(P＜0.05)，IκBα降解明顯被抑制。
　　結(jié)論：自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠肝臟及脂肪組織中NF-κB炎癥信號(hào)通路被激活，IκKβ及IκBα蛋白的磷酸化水平升高，