肝癌細(xì)胞中熱休克蛋白27相互作用蛋白質(zhì)的分離和鑒定.pdf

1、目的： 肝癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，對化療和放療均不敏感，手術(shù)根治率僅占15％，容易早期轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移又是腫瘤最重要的惡性表型之一，是一個多分子參與高度復(fù)雜有序的過程。有研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白在人類癌癥大范圍的過度表達(dá)，并且牽涉腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移、死亡，并被免疫系統(tǒng)識別。熱休克蛋白27（HSP27）作為小熱休克蛋白亞家族中的重要一員，近年來與腫瘤的關(guān)系日益受到重視，它通過對細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞凋亡

2、的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)參與了一些腫瘤的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移過程，具體機(jī)制仍不十分清楚，但越來越多的證據(jù)顯示細(xì)胞凋亡與腫瘤轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)通過對HSP27及其結(jié)合蛋白的研究，篩選出肝癌中HSP27的相互作用蛋白，為下一步探索基因治療腫瘤及其轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。 方法： 1.采用DMEM培養(yǎng)液（含10％小牛血清）培育肝癌HepG2.2215細(xì)胞。 2.M-PER蛋白裂解液收集HepG2.2215細(xì)胞總蛋白。 3.

3、采用免疫共沉淀技術(shù)從HepG2.2215細(xì)胞總蛋白得到相應(yīng)的HSP27結(jié)合蛋白，直接酶解后進(jìn)行液相色譜-電噴霧離子阱串聯(lián)質(zhì)譜分析（LC-ESI-ITMS/MS），得到相應(yīng)的肽序列標(biāo)簽（peptide sequence tags，PST）。 4.用免疫共沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析技術(shù)對所鑒定的HSP27相互作用蛋白之一HSP90進(jìn)行了驗(yàn)證。 結(jié)果： 通過搜索數(shù)據(jù)庫在肝癌細(xì)胞系中首次鑒定了7個HSP27結(jié)合蛋白，分別是熱休

4、克蛋白90（HSP90）、熱休克蛋白70（HSP70）、特異性下調(diào)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP-78）、賴氨酰羥化酶（lysyl hydroxylase）、細(xì)胞角蛋白9（Keratin，typeⅠ cytoskeletal9）、細(xì)胞角蛋白10（Keratin，typeⅠ cytoskeletal10）和細(xì)胞角蛋白1（Keratin，typeⅡ cytoskeletal1）。所鑒定的7個結(jié)合蛋白可以劃分為三個作用范疇，分別是：分子伴侶、細(xì)胞