日本血吸蟲鈣網(wǎng)質(zhì)蛋白免疫生物學功能的初步研究.pdf

1、研究表明，輻照致弱血吸蟲疫苗能夠誘生高保護性免疫效果，其機制可能是通過輻照致弱血吸蟲來源的分子刺激宿主免疫細胞在肺部形成了以Th1為主的致炎性環(huán)境而實現(xiàn)的。因此，發(fā)現(xiàn)和鑒定這些保護性分子并闡明其免疫生物學功能，對研發(fā)高效安全的抗血吸蟲分子疫苗具有重要的指導意義。
　　本文旨在研究日本血吸蟲鈣網(wǎng)質(zhì)蛋白(SchistosomajaponicumCalreticulin,SjCRT)在先天性免疫應答和獲得性免疫應答中的作用和功能，以期為

2、闡明輻照致弱血吸蟲疫苗的保護機制提供依據(jù)。
　　1、SjCRT在不同期別正常及輻照致弱童蟲上的表達。體外培養(yǎng)不同期別的輻照和正常童蟲，用胰酶消化成單個細胞。流式細胞術檢測結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)4 d時SjCRT在輻照組蟲體細胞內(nèi)的表達量明顯高于正常組(P<0.05)；而7 d、10 d和14 d時，SjCRT在輻照組蟲體細胞內(nèi)的表達量明顯低于正常組(P<0.05)。RT-PCR檢測SjCRT轉(zhuǎn)錄水平變化，發(fā)現(xiàn)輻照組在7 d顯著高于正常

3、組(P<0.05)，在10 d時兩組無顯著差異。初步推斷在輻照早期4 d時SjCRT在蟲體細胞內(nèi)呈現(xiàn)高表達，隨著體外培養(yǎng)時間推移，SjCRT釋放到細胞外。
　　2、SjCRT活化宿主巨噬細胞的初步研究。SjCRT與RAW264.7細胞共孵育72 h，通過MTT檢測細胞增殖情況、Griess法檢測胞外 NO含量、RT-PCR法檢測巨噬細胞上幾種細胞因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄水平的表達、ELISA檢測胞外細胞因子、流式細胞術檢測細胞表面分子。

4、MTT結(jié)果顯示，SjCRT能夠顯著促進巨噬細胞增殖(P<0.05)；RT-PCR結(jié)果顯示SjCRT促進巨噬細胞上調(diào)表達COX-2、cPLA2、CCR7、TNF-α和IL-1βmRNA；Griess法結(jié)果提示，SjCRT能夠促進巨噬細胞分泌NO(P<0.01)；ELISA結(jié)果表明SjCRT能夠極其顯著地促進巨噬細胞分泌TNF-α(P<0.01)；流式細胞術表明，未經(jīng)處理的巨噬細胞能表達一定水平的CCR7，但SjCRT的刺激能使巨噬細胞表面

5、趨化因子受體CCR7的表達水平極顯著地增加(P<0.05)。提示SjCRT可以活化巨噬細胞。
　　3、探究SjCRT活化宿主DC的機制。通過激光共聚焦和流式細胞術研究SjCRT與DC的結(jié)合情況、RT-PCR檢測DC上幾種細胞因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄水平的表達情況、ELISA檢測DC培養(yǎng)上清中細胞因子表達情況、流式細胞術檢測DC表面CCR7和CXCR4表達情況、CFSE法檢測CD4+T細胞增殖、ELISA檢測CD4+T細胞胞外細胞因子分泌

6、情況。結(jié)果：SjCRT可以結(jié)合在DC表面，它能夠與DC表面的CD91受體結(jié)合進而被介導內(nèi)吞；RT-PCR結(jié)果顯示與未刺激相比， SjCRT的刺激可以促進 DC極其顯著地上調(diào) TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、CXCL-2、CCR7和CXCR4這幾種細胞因子和趨化因子的mRNA的表達(P<0.01)；SjCRT的刺激也能促進DC極其顯著的表達并分泌TNF-α、IFN-γ和IL-4，并且差異極其顯著(P<0.01)；流式結(jié)果顯示

7、SjCRT的刺激能使細胞表面趨化因子受體CCR7和CXCR4的表達水平極顯著地增加(P<0.01)；CFSE法表明SjCRT刺激組有明顯的增殖現(xiàn)象，增殖細胞百分比分別為47.7％和44.1%；ELISA檢測CD4+T細胞胞外細胞因子分泌情況，顯示SjCRT刺激48h后的DC能夠促進T細胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10，并且與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果提示：SjCRT能夠促進DC功能成熟。
　　4、

8、SjCRT誘導致敏小鼠混合淋巴細胞反應。SjCRT刺激致敏小鼠淋巴細胞48 h后，MTT法檢測淋巴細胞增殖、流式細胞術檢測淋巴細胞亞群狀況以及胞內(nèi)細胞因子的表達情況。結(jié)果顯示該蛋白能夠顯著地刺激致敏小鼠淋巴細胞增殖(SI>2)；蛋白免疫組CD4+/CD8+T細胞的比值為2.26顯著高于對照組的1.76(P<0.01)，且胞內(nèi)IFN-γ的表達量顯著增加(P<0.05)。提示SjCRT可以誘導小鼠產(chǎn)生Th1型免疫應答反應。
　　綜上所