日本血吸蟲分子生物學(xué)及生物信息學(xué)研究與應(yīng)用.pdf

1、目的：研究體外培養(yǎng)日本血吸蟲成蟲細(xì)胞,試圖引起血吸蟲成蟲細(xì)胞的分裂,尋求引起血吸蟲細(xì)胞增殖分裂的有效物質(zhì),為獲得日本血吸蟲體外培養(yǎng)無限增殖的細(xì)胞系提供參考和依據(jù)。模擬自然界的疫水,富集毛蚴并提取毛蚴基因組DNA,建立一種靈敏、特異的痕量檢測日本血吸蟲毛蚴的PCR方法。研究日本血吸蟲DNA序列片段的2-D圖形表示和3-D圖形表示,從不同角度反映隱藏在DNA序列中的生物學(xué)上的特征,來尋找所隱藏的生物學(xué)的基本規(guī)律,為下一步在生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證

2、規(guī)律,指導(dǎo)實(shí)驗(yàn),并發(fā)掘更深層次生命的本質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：取感染7～8w日本血吸蟲的小鼠,頸椎脫臼法處死,無菌條件下挑取日本血吸蟲成蟲若干條,以20條為一組,剪碎后用改良日本血吸蟲細(xì)胞體外培養(yǎng)方法培養(yǎng),Olympus倒置顯微鏡下拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。隨機(jī)抽取兩個培養(yǎng)瓶離心收集細(xì)胞,制備日本血吸蟲染色體,Olympus-CX31顯微鏡下觀察,鑒定日本血吸蟲成蟲細(xì)胞的存活狀況。把培養(yǎng)瓶隨機(jī)分為三組,分別向其中加促細(xì)胞分裂物質(zhì)bFG

3、F,IL-2和Con A,并對培養(yǎng)瓶依次做標(biāo)記,放在相同的環(huán)境和條件中進(jìn)行培養(yǎng),定點(diǎn)定位連續(xù)觀察體外培養(yǎng)日本血吸蟲成蟲細(xì)胞的生長狀況,并用Olympus數(shù)碼相機(jī)在Olympus倒置顯微鏡下進(jìn)行顯微攝影。
　　 取感染6～8w日本血吸蟲的小鼠肝臟,碾磨后沉淀,孵化并利用間接連續(xù)離心法富集毛蚴,采用蛋白酶K-苯酚法提取毛蚴基因組DNA。登陸GenBank查詢獲得日本血吸蟲保守序列18S小亞基單位核糖體脫氧核酸(18S rDNA)基因

4、,利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier5.0和Oligo6自主設(shè)計(jì)一對引物,建立水體檢測日本血吸蟲毛蚴的PCR方法。梯度稀釋血吸蟲毛蚴基因組DNA進(jìn)行PCR方法的靈敏性試驗(yàn),設(shè)置陰性對照,PCR產(chǎn)物通過電泳鑒定。
　　 選取平面直角坐標(biāo)系的兩個坐標(biāo)軸的4個方向分別代表4種核苷酸堿基來作DNA序列片段的2-D圖形表示。畫出相互間隔一個單位的4條水平線,并讓A,C,G,T這4種堿基分別與這4條水平線對應(yīng),對應(yīng)堿基描點(diǎn),用直線

5、連接所有相鄰的點(diǎn),最終得到DNA序列片段的“四水平線”圖。將4個三維空間中的向量分別賦予DNA序列的4種堿基:(1,0,0)→A,(0,1,0)→C,(0,0,1)→G和(1,1,1)→T。根據(jù)向量來制作DNA序列片段的點(diǎn)的坐標(biāo)。再用直線連接相鄰的點(diǎn)而得到DNA序列片段的3-D曲線。最后將DNA序列片段的3-D曲線投影到2維平面,比較其形狀并進(jìn)行分析。找出DNA序列的特征序列,構(gòu)建基于特征序列的DNA序列片段的“雙水平線”圖。構(gòu)建DNA

6、序列片段的有向圖,作圖方法同前面的DNA序列片段的2-D圖形表示一樣,只不過在連接相鄰的點(diǎn)時用的是有向箭頭而非線段。
　　 結(jié)果：(1)血吸蟲成蟲細(xì)胞在Olympus倒置顯微鏡下呈球形、色澤鮮亮,不添加任何促細(xì)胞分裂物質(zhì)的情況下,細(xì)胞數(shù)量起初隨時間的增長而有所增多。但隨著時間進(jìn)一步推移,觀察定位的血吸蟲細(xì)胞卻“不增殖、不傳代”,幾乎很難看到細(xì)胞密度的明顯變化。制備日本血吸蟲染色體,在油鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)隨機(jī)抽取的兩瓶細(xì)胞均存在分裂中

7、期相,并且染色體數(shù)目n=8。不同的促細(xì)胞分裂物質(zhì)對血吸’蟲成蟲細(xì)胞的影響不完全相同。添加bFGF的血吸蟲細(xì)胞增殖并不明顯,而添加IL-2和Con A的血吸蟲細(xì)胞個數(shù)明顯增多。其中,添加IL-2的血吸蟲細(xì)胞增殖個數(shù)最多,最為明顯。
　　 (2)PCR擴(kuò)增日本血吸蟲毛蚴得到特異性DNA片段,片段長度為463bp,陰性對照組無擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR法可檢測出日本血吸蟲毛蚴DNA的最低濃度為62.5pg/μL。
　　 (3)依次得到了

8、DNA序列片段的2-D圖形表示、“四水平線”圖、3-D曲線、“雙水平線”圖和DNA序列片段的有向圖,并進(jìn)行比較分析。
　　 結(jié)論：在不添加任何促細(xì)胞分裂物質(zhì)的情況下,日本血吸蟲成蟲細(xì)胞體外培養(yǎng)“不增殖、不傳代”,幾乎很難看到細(xì)胞密度的明顯變化；促細(xì)胞分裂物質(zhì)bFGF對日本血吸蟲成蟲細(xì)胞的增殖沒有明顯促進(jìn)作用,而IL-2和Con A對日本血吸蟲成蟲細(xì)胞的增殖有明顯促進(jìn)作用,并且IL-2的促進(jìn)作用最為明顯。建立的水體檢測日本血吸蟲毛

9、蚴的PCR方法靈敏、特異,具有一定的預(yù)警作用。DNA序列片段的2-D圖形表示和3-D圖形表示能從不同角度反映隱藏在DNA序列中的生物學(xué)上的特征。DNA序列片段的2-D圖形表示由于簡并現(xiàn)象導(dǎo)致信息丟失,但DNA序列片段的3-D曲線卻避免了因與自身相交或重疊而導(dǎo)致的簡并現(xiàn)象。DNA序列片段的有向圖表示的簡并度比相應(yīng)無向圖的低得多,甚至在某些時候下將不再出現(xiàn)簡并現(xiàn)象。而且,在有向圖中,我們所看到的實(shí)際上正是沿著生物序列“游走”時的“歷史”。因